肽聚糖的结构与合成

肽聚糖是革兰氏阳性细胞壁的主要成分。它由交替的N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）和N-乙酰壁酸（MurNAc）组成的聚糖链组成，通过β-1,4键连接。肽链通过其N末端与MurNAc的内酰胺基共价连接。这些肽链的组成因物种而异，可以通过一个或多个氨基酸的短链直接或间接交联，从而在细胞周围形成三维结构，从而确保细菌的完整性。在实验室中，茎肽的氨基酸序列是L-Ala-γ-D-Glu-X-D-Ala，而第三个氨基酸（X）是双氨基酸。它通常是L-赖氨酸（例如，在乳酸杆菌和大多数乳酸杆菌中），但也可以是中二氨基丙烯酸（mDAP）（例如，在植物乳中）或L-鸟氨酸（例如，在发酵乳中）。在乳酸菌中，D-Ala在新合成的肽聚糖的第5位占优势；然而，D-Lac残基存在于天然的抗万古霉素乳酸杆菌中，如干酪乳杆菌和植物乳杆菌。相邻茎肽之间的交联发生在一条肽链第四位的D-Ala和另一条肽链第三位的二氨基酸（4-3交联）之间。在mDAP型肽聚糖中可以看到直接的交叉连接，这种交叉连接通常存在于革兰氏阴性菌中，但也存在于植物乳杆菌中。在其他实验室中，发现了Lys型肽聚糖，并且包括由一种D-氨基酸（例如，乳酸杆菌、干酪乳杆菌和大多数乳酸杆菌中的D-Asp或D-Asn）或几种L-氨基酸（例如，嗜热链球菌中的L-Ala2或L-Ala3）构成的肽间桥。

肽聚糖结构是在乳酸杆菌和许多乳酸杆菌中发现的结构类型。在其他实验室物种中，肽间跨桥（图中描绘为D-Asp/D-Asn）的性质可能不同，第三个二氨基酸（L-Lys）可被mDAP或L-鸟氨酸取代，并且茎肽第五位的D-Ala可被D-乳酸取代。肽聚糖结构的可能修饰，例如O-乙酰化（O-Ac）、N-脱乙酰化（导致GlcNH2）或酰胺化（NH2）。

尽管给定的细菌种类具有基本的、特征性的肽聚糖结构，但是肽聚糖层在细菌的整个生命周期中始终处于动态状态，肽聚糖结构是复杂的生物合成、成熟和降解反应的结果。利用高效液相色谱和质谱对肽聚糖 muropeptides进行结构分析，可以鉴定肽桥的性质、交联程度以及成熟和水解事件的频率。它还揭示了共价肽聚糖修饰的存在，如O-乙酰化、N-脱乙酰化或酰胺化；这些修饰可能在细菌生理学中发挥重要作用。一些实验室已经确定了详细的肽聚糖结构，包括乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌。前三个物种被发现具有D-Ala4-D-Asp/Asn-L-Lys3跨桥，而后者具有直接的D-Ala4-mDAP3跨桥。

肽聚糖的合成可分为三个步骤：第一步发生在细胞质中并导致脂质II的合成，第二步涉及脂质II转移到膜的细胞外侧，第三步导致合成的亚单位聚合成大分子。

肽聚糖和壁磷壁酸生物合成主要步骤示意图。灰色箭头表示肽聚糖生物合成的步骤，棕色箭头表示WTA生物合成的步骤。膜包埋十一烯基磷酸酯载体用深灰色曲线表示，甘油磷酸单元用绿色圆圈表示。PBP和LCP形成的连接用红色箭头表示。预先存在的肽聚糖以灰色突出显示。在示意图中，D-Asp被添加到脂质前体中；但是，根据细菌种类，D-Asp也可以添加到可溶性前体中。

脂质Ⅱ的组装始于尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）的合成，通过葡萄糖胺的酶促转化为能量激活的UDP-GlcNAc。UDP-MurNAc然后由UDP-GlcNAc生成，经过两个连续的酶促反应：烯醇式丙酮酸UDP-GlcNAc的合成及其随后的还原，这是由MurA和MurB催化的。然后，UDP-MurNAc五肽前体在Mur连接酶催化的一系列连续的ATP依赖酶步骤中组装。MurC和murd分别催化L-Ala和D-Glu的加成，MurE催化L-Lys和mDAP的加成。最后，在一个步骤中，MurF以二肽（D-Ala-D-Ala）或二肽（D-Ala-D-Lac）的形式添加两个残基，其合成需要D-D-连接酶（Ddl）。特定的消旋酶将丙氨酸和谷氨酸的天然L-立体异构体转化为肽聚糖中发现的D-形式[25]。此外，在植物乳杆菌中，它合成以D-Lac终止的前体，D-Ala-D-Ala-二肽酶（Aad）消除由Ddl连接酶产生的D-Ala-D-Ala二肽，从而阻止它们并入前体。在异源表达植物乳杆菌Ddl连接酶基因的条件下，成功地在乳酸乳杆菌中产生了以D-Ala-D-Lac而不是D-Ala-D-Ala终止的肽聚糖前体。肽聚糖前体的干肽的最后残基的修饰已被证明会导致肽聚糖结构和细胞形态的显著改变。UDP-MurNAc五肽然后通过膜转移酶MraY与脂质转运蛋白bactoprenol（十一烯丙基磷酸酯）的焦磷酸连接，该过程产生十一烯丙基焦磷酸基MurNAc五肽或脂质I。最后，糖基转移酶MurG将GlcNAc添加到脂质I中，形成十一烯基焦磷酰二糖五肽或脂质II，这是用于肽聚糖组装的基本亚单位。

在细胞质中发生的另一个重要的酶促步骤是肽侧链的组装，根据物种的不同，肽侧链被添加到核苷酸MurNAc五肽或脂质前体中。天冬氨酸连接酶将D-Asp添加到茎肽的第三个氨基酸（L-Lys）中，D-Asp是最常见于乳酸杆菌侧链中的氨基酸，存在于乳酸杆菌和大多数乳酸杆菌中。这种酶属于ATP GRAP家族，包括催化ATP依赖的羧酸盐-胺连接反应的酶，以及使用活化的D-Asp（以β-天冬氨酸磷酸的形式）作为底物的酶。D-Asp是由racD编码的天冬氨酸消旋酶由L-Asp产生的，racD与乳酸杆菌中的天冬氨酸连接酶基因位于同一操纵子中。肽聚糖侧链的L-氨基酸通过特定的转移酶从氨基酰基tRNA转移，在粪肠球菌中被鉴定为BppA1和BppA2，粪肠球菌是一种具有L-Ala-L-Ala跨桥的物种，如嗜热链球菌。

脂质II（带或不带侧链）然后通过翻转酶转移到细胞质膜外。完整的膜蛋白FtsW已被证明可以跨膜转运脂质连接的肽聚糖前体，并被认为在隔膜水平起作用。RodA同源蛋白似乎参与卵子球菌和杆菌细胞伸长期间的侧向肽聚糖合成。

在肽聚糖合成的最后一步，肽聚糖单体单元通过发生在细胞质膜外的转肽和转糖基化反应聚合。参与肽聚糖组装的主要蛋白质被称为青霉素结合蛋白，因为它们是青霉素和其他β-内酰胺抗生素的靶点。A类青霉素结合蛋白分别在蛋白的N端和C端含有转糖基化和转肽结构域，而B类青霉素结合蛋白仅参与转肽。在转糖基化过程中，脂质II的双糖与预先存在的肽聚糖链结合；杆菌烯醇失去一个无机磷酸盐，并被循环到细胞质膜的内侧以启动另一轮。为了在细菌细胞周围形成一个坚固的肽聚糖网，新延伸的链必须通过转肽作用连接到相邻的链上。一条五肽链（供体链）第四位的D-Ala的羰基与第二条肽链第三位的二氨基酸或连接的侧链氨基酸（受体链）的游离胺之间形成共价键。这一步骤导致供体链的C-末端D-Ala或D-Lac的释放。另一种3-3交叉链需要L，D-转肽酶，而不是青霉素结合蛋白。

对卵球菌属乳酸乳杆菌（L.lactis）的基因组分析表明存在六种多溴联苯：五种高分子量（HMW）多溴联苯（PBP1a、PBP1b、PBP2a、PBP2b和PBPx）和一种低分子量（LMW）多溴联苯（D-Ala-D-Ala-羧肽酶DacA）。乳酸菌还拥有一种L，D-羧肽酶（DacB），它能切割茎肽的L-Lys3-D-Ala4键。卵母细胞同时表现为间隔生长和周边生长，这导致轻微的纵向扩张，形成卵圆形。研究表明，侧生或隔生是由功能不同的肽聚糖生物合成机制介导的，每种机制分别受特定的B类PBP（PBP2b和PBP2x）的控制。其他多溴联苯似乎具有冗余功能，在两种生物合成途径中都起作用。此外，有人提出，PBP2x和PBP2b活性的改变会直接影响乳酸杆菌在浮游生物和生物膜中生长过程中观察到的球菌到杆的转变和进一步的丝状化。

只有部分肽聚糖茎肽通过转肽连接，交联程度是肽聚糖的特征。在指数生长阶段，乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的交联指数分别为35.5%、37.5%、34%和36.5%。D、 D-羧肽酶DacA和L，D-羧肽酶DacB参与肽聚糖成熟，从而在成熟肽聚糖中产生四肽链和三肽链。

另一个可能影响肽聚糖结构的重要特征是聚糖链长度。在乳酸乳杆菌中，经过酰胺酶处理后，检测到长聚糖链（含有超过50个双糖的链，占所有链的50%）。用原子力显微镜（AFM）观察了活乳杆菌细胞中肽聚糖纳米结构。当使用带有肽聚糖结合LysM结构域的功能化尖端对其表面不含多糖的突变体成像时，发现肽聚糖以平行于细胞短轴的电缆形式排列。

在大多数细菌物种中，肽聚糖的基本结构是部分修饰的——要么聚糖链经历N-脱乙酰化或O-乙酰化，要么肽链中氨基酸的游离羧基被酰胺化。这些结构修饰通常具有功能性后果，它们可以调节真核生物（如溶菌酶）产生的内源性肽聚糖水解酶（肽聚糖Hs）以及外源性肽聚糖Hs的活性。肽聚糖修饰已被证明可以让病原菌从宿主的固有免疫系统中逃逸。