脑科学追梦人（二）

                                         王庆浩

（续前）

9. 胚胎脑细胞/神经板损伤实验

前面说过：精子进入点将发育为大脑，其对称点被称为组织者，决定大脑发育。发育到mid neurula阶段的神经板（neural plate）将发育为大脑。理论上损毁这三个点将会影响大脑的发育。我们完全看不到精子进入卵子的地方，因此精子进入点和其对称点不太好辨认。但神经胚却很好辨认，其头部是神经板也很容易辨认，因此先做神经板损伤实验。

找到合适的实验动物卵之后，就开始按照设想进行受精卵大脑发育过程的损毁实验了。但真做起来并不是很容易的。由于刚刚发育的大脑比针尖还小，在显微镜下用玻璃针切割并不是很容易的。手抖一下，位置就偏离了，总是做不准。但这不是很难，练习一段时间，手就不抖了，切割就比较准确，此时可以做蝌蚪大脑细胞损毁实验了。

事实上，下一步要用玻璃针做大脑内部的损伤实验也不容易。因为胚胎外面还有一层卵膜，胚胎在卵膜内是转动的。针刺进去后胚胎来回转动，没法切割损伤任何一点。这就必需找到办法将其固定下来。外部有一层卵膜，如何通过外膜固定内部的胚胎并不容易。通过反复摸索，最后终于找到了固定胚胎的方法：四针固定法。用四个玻璃针，分别斜插在胚胎的前后，前部二针，后部二针，这样胚胎被固定下来了。再用玻璃针进行2项操作：①玻璃针进行切割去除胚胎前部发育为大脑的一部分。②玻璃针搅动损伤胚胎前部发育为大脑的一部分。

具体实验如下：

先用琼脂糖在小培养皿里制成凝胶，用后放在水中，可以反复应用。

2015年2月18日，蝌蚪端脑损毁实验：将凝胶放在显微镜下，用小吸管将tail-bud stage蝌蚪吸出放在凝胶上，玻璃针刺穿大脑，损毁蝌蚪的端脑，总数做了16个。19日观察结果：12个死亡，4个存活。之后又观察几天，存活蝌蚪端脑与正常蝌蚪形态一样，似乎恢复原样，行为没有任何变化，与实验设想完全相反，这是实验之前没有考虑到的。

从2015年2月到5月，做了大量的蝌蚪端脑、前脑、中脑和后脑损毁实验，大多数实验蝌蚪都会死亡，少数不死蝌蚪大脑形态与正常蝌蚪没有明显变化，行为也没有异常。

  上述实验结果都显示，一部分胚胎死亡了，没有死亡的胚胎发育为了完整的大脑，再发育为蝌蚪和小蛙后，行为没有任何变化。反复实验许多次，结果都一样。这个结果完全出乎意料，与设想完全相反。这个实验证明了动物的大脑发育具有强大的“鲁棒性”，局部的损伤根本改变不了大脑的发育。这种奇特的现象，不仅让人惊叹于蛙卵的惊人的大脑发育的适应能力，也让我对脑科学的奇妙性产生了更深的思考。用玻璃针切割和损毁的方法来研究大脑发育的鲁棒性或许是可行的，但用于研究脑胚损毁位点与大脑支配的行为的关系却不可行。

        整体来说，没有观察到蝌蚪和小蛙行为有任何变化，实验失败了。

  脑科学难度非常大，完全是探索性实验，根本不知道哪条路是可行的。既然物理切割和损伤不可行，那就试一试异物填塞到蝌蚪的大脑中会发生什么现象吧。

10. 蝌蚪大脑异物填塞实验

  把异物填塞进蝌蚪大脑不同部位会发生什么？为了解答这个问题，我在2015年6月到2016年底进行了一些列的实验。微米的颗粒很好制造，用锤子砸碎各种物体如玻璃、绿豆、木屑等，或者直接选用一些微细颗粒如细沙等，放在显微镜下除去大颗粒，选择微颗粒。但蝌蚪的大脑很小，是微米级的。要把微米的异物颗粒填进微米级的大脑可不是很容易的。微米的颗粒如何用镊子镊取？根本没有这么微小的镊子。经过反复思考，终于想到了一个方法：用玻璃针沾胶水沾取微粒。先用玻璃针刺破蝌蚪大脑，然后用带胶水的玻璃针沾取微粒放在刺破处，再用玻璃针将微粒导入蝌蚪大脑。用这种方法将铁微粒、砂微粒、木屑、纸屑、玻璃微粒，绿豆微粒等10多种异物放入蝌蚪大脑不同位置，观察结果与蝌蚪脑细胞损毁实验相同，除了大部分蝌蚪死亡之外，存活蝌蚪行为没有异常。

11.寻找合适的化学试剂

化学试剂非常繁多，国际上有几十万种，我国常用试剂也有几万种。常见的药物也有几百种。一些试剂和药物是重合的，例如乙醇既是试剂也是药物。要想在几十万个试剂中筛选出合适的几种并不是一件容易之事。先查询哪些药物会造成胚胎畸形，理论推测这些药物应该可以使用。然后就是使用家中常用药，因为简便易得。先后试用了下列药品和试剂：

乙醇、丙醇、维甲酸、甲氨蝶呤、环磷酰胺、秋水仙碱、对乙酰氨基酚、头孢拉定、左氧氟沙星、布洛芬、多酶片、氢化可的松、地塞米松、阿昔洛韦等等。

  实验之后发现上述药物和试剂既不会造成胚胎明显的损伤，也不会造成蝌蚪行为明显的改变。这些化合物都不合适。

  一个偶然的机会发现了一种非常合适化合物LDX。将热带爪蟾的卵放入这种试剂之中，如同钠放在水中一样，一二分钟之内，整个卵被完全消化掉了，完全无影无踪。这种化合物损毁胚胎的组织，小剂量小损毁大剂量大损毁，具有量效关系，非常合适做这个实验。这里有机遇，完全是歪打正着。当时在做其他方面的实验，结果发现它有损毁胚胎组织方面的作用，否则三五年也找不到。

  是功夫不负有心人，还是上帝的青睐？不管外界多么噪杂，总有科研人员在默默求索，只有负重前行才感觉岁月美好！实验的成功真的很好很好，内心有说不出的愉快和欢乐！实验真奇妙，实验真奇妙！下一步就可以做“化学试剂损毁胚胎实验”了。

12.化学试剂损毁胚胎实验

 用LDX试剂损伤胚胎各个部分，但结果与“胚胎脑细胞/神经板损伤实验”相同，又是要么死亡了，要么大脑发育完整，行为没有任何异常。还在沉醉于找到了理想的化学试剂的喜悦之时，实验又失败了。

13. 蝌蚪大脑切割实验

  做了很多蝌蚪脑细胞损毁实验和蝌蚪大脑异物填塞实验都没有取得预料的结果，或许切除蝌蚪的一部分大脑可以产生预料不到的结果，于是在2017年到2019年进行了蝌蚪大脑切割实验。

  先把蝌蚪大脑划区，切除前部分1/4，再切除中间部分1/4，再切除后部分1/4，结果除了少数死亡外，大部分大脑形态没有变化，行为也没有异常。接着做了切除1/3,1/2，仍然没有异常。再做切除前脑、中脑和后脑实验，行为仍然没有明显异常。最后把整个大脑全切除了，胚胎仍然可以发育，仍然存活，但却出现明显异常，蝌蚪发育不完善，可以发育出脊髓，但没有头，没有内脏器官。但令人惊奇的是，这些无头胚胎仍然对刺激有反应，仍然可以游动，只能向前游动，不能后退，几天后当卵黄囊的营养耗尽之后就会死亡。这可能是人类第一次发现这种奇特现象，这些实验不仅让人惊叹于无头胚胎的智慧和适应能力，也让我对脑科学的奇妙性产生了更深的思考，引导我向着大脑的奥秘探索。胚胎没有头却对刺激有反应，却可以游动，这引起了我极大的好奇心，于是转向了断头动物的实验研究。

（未完待续）

将我对脑科学研究所想所做写下来，与同道分享再好不过了，这或许可以有助于大脑之谜的早日揭开