如果是用的windows系统，可能不会出现这样的问题，我的primer3在windows下也没遇到这样的问题，linux系统有可能遇到。

     当我遇到这个问题时，搜到下面这个链接的帖子：

http://bio-spring.info/wp/?p=211

   这个帖子的解决问题的思路是对的，只是时间比较早了。那时来进行引物设计的模块为（或者是他用的模块）：Bio：：PrimerDesigner：：primer3。我用的模块为Bio::Tools::Run::Primer3,这个模块的位置是：/usr/share/perl5/Bio/Tools/Run/Primer3.pm.所以得对这个Primer3.pm文件下手。如果不知道Bio文件夹的位置可以这样搜：find /usr -name Bio.要修改这个文件得这样：sudo vim Primer3.pm(也就是要获得超级用户的权限）。需要修改的位置为（我粘贴出来的是我改过以后的）：

1：

   push (@input, ("PRIMER_SEQUENCE_ID=".$self->{'seqobject'}->id)（第268行，这行不需要改）,

                               ("SEQUENCE_TEMPLATE=".$self->{'seqobject'}->seq)（第269行）

2：

$self->{'seqobject'}->id),("SEQUENCE_TEMPLATE=".$self->{'seqobject'}->seq));（第369行）

3：

if ($input =~ /SEQUENCE_TEMPLATE(.*)/) {$sequencelength=length($1)}（第385行）

4：

'SEQUENCE_TEMPLATE'=>'(nucleotide sequence, REQUIRED) The sequence itself. Cannot contain newlines',（第585行）

这4处修改以后，保存就可以正常运行了。这东西我也折腾了点时间。其实问题的解决主要来自于下面两个例子的比较：

example1文件内容：

SEQUENCE_ID=example

SEQUENCE_TEMPLATE=GTAGTCAGTAGACNATGACNACTGACGATGCAGACNACACACACACACACAGCACACAGGTATTAGTGGGCCATTCGATCCCGACCCAAATCGATAGCTACGATGACG

SEQUENCE_TARGET=37,21

PRIMER_TASK=pick_detection_primers

PRIMER_PICK_LEFT_PRIMER=1

PRIMER_PICK_INTERNAL_OLIGO=1

PRIMER_PICK_RIGHT_PRIMER=1

PRIMER_OPT_SIZE=18

PRIMER_MIN_SIZE=15

PRIMER_MAX_SIZE=21

PRIMER_MAX_NS_ACCEPTED=1

PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE=75-100

P3_FILE_FLAG=1

SEQUENCE_INTERNAL_EXCLUDED_REGION=37,21

PRIMER_EXPLAIN_FLAG=1

=

........................

example2 文件内容

PRIMER_SEQUENCE_ID=chr01|13101chr01_2772263:2772992

SEQUENCE=GATGATGAGACTACTGAAGAGGTACTCAATCTTTTTTTACCATTCATTTGTCCTGCTGGAGCACTGTGTAGTAGACAGTTCAAGCTAGTCATCTTAGAAAATCACTATTCCCCTTAAAATAGTCCGTGTGAATCATAACAAATTTCAATTACTGATGTAAAACGGACAGCAGGGAGGACCTGAGGAAAGATACAATTCCAGTAGCAACAAGAAACTTCCAAATTACTCCGGAAAGAAGGGCAAAAGATCAAAGAGGAAGCGCATGGTTCAGTAGGTGTGACAGAACCTGATTGGATTTCATTTTTGTCATTACTGGTAAGTACTATGAACACACAAACACCTTTTTATAAAGAAGCTCACTAGCTTATTTGAATTCTGGAGTTCATGTTTTTTAAGTGGCAAAAAAGAAAGGTTTATACTCTATCTTATCATATGTCCTTGATCAATTGGTGTTAATGTCATGTACATTTACAAATACAGGTTAATTCAGTTGGCCAGTACGGTTGTGTAGTTGATCTCGGACACAATTTTGATGATCAGTTGGGAAGGCTAATCTTCAGGTGCAGGACAGACACGAAACATTCCAGTGGTACAGGTGTTTTGCTGGCACACAGCAAGATGAAAATAGTTCAGTACACTACAATAGGTTTGAGAGGATAGGCATGGCTTGAGTATGTGCTACAACATAAGAGTAGTACACAAATTATTCTTGTGCTACTCTGCAATG

PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE=80-120

PRIMER_MIN_TM=50

TARGET=150,24

PRIMER_OPT_TM=55

PRIMER_MAX_TM=60

INCLUDED_REGION=40,120

PRIMER_NUM_RETURN=1

=

在命令行使用：primer3_core <example1和primer3_core <example2，example1能正常运行，但example2不能，但是把example2中的"SEQUENCE="替换为"SEQUENCE_TEMPLATE=",文件example2也能正常运行了，所以，关键之处在这.example是primer3自带的例子，位置为：/usr/share/doc/primer3/examples/example