质粒的单酶切与磷酸酶处理

实验目的：制备用于重组法克隆所需的单酶切质粒

试剂耗材：

          单酶切试剂，DNA胶回收试剂盒，磷酸酶试剂，PCR产物纯化试剂盒或DNA纯化试剂盒。金属浴，水浴锅，微量样品紫外分光光度计，离心机等。

实验样品：质粒DNA。

实验步骤：

          （1）单酶切：测质粒浓度，按说明书配制酶切体系（也可能需要进行双酶切），设置对照组（不加酶），一般水浴过夜酶切。

          （2）胶回收：跑胶时，不必加DNA标准，但需要加未酶切的质粒作为对照。按说明书进行胶回收。

          （3）磷酸酶处理：测胶回收产物浓度，按说明书配制磷酸酶处理体系，处理30分钟至1小时（温度设置参考试剂说明，NEB及TAKARA之CIP为37度30分钟）。此步骤是为了去除质粒单切后DNA末端的磷酸，使单切后质粒不能自连。

          （4）DNA磷酸酶处理产物纯化：按说明书，用PCR产物纯化试剂盒回收磷酸酶处理的质粒单切片段，最终洗脱用水。

          （5）测浓度，-20度保存，或进行重组法质粒构建。如浓度很大，可以稀释分装。

问题分析：

          （1）最终回收的单切片段浓度需大于20ng/μL。

          （2）如何提高胶回收效率？

          （3）避免内切酶的星号活性，避免在胶回收线形质粒时将环形质粒一并回收。