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其实这就是人生吧!
我们发现了两个天煞的蛋白能结合在一起,而且一个会抑制另一个的活性。但具体的机制,也就是说,这两个蛋白背地里干了什么事儿导致其中一个活性丧失,我们目前还不清楚。今年,2014年,整整一年,我的工作就是围绕这个问题展开的。我们打算在体外纯化蛋白,然后做各种活性测定和单分子成像,想亲眼看看,这两个天煞蛋白是怎么互相折腾的。想想又能发一篇灌水文章,心里不免窃喜。嚯嚯霍。。
老板也是个催命鬼,我最清楚不过了。我给老板下了军令状,算上构建质粒,大概两个月时间,就能把这两个蛋白及其不同结构域都纯化出来,送出去测。结果,我算上栽在这两个天煞的蛋白上了。现在想想,也许当时应该观天象,选个吉日开始工作才是。
我们打算在这两个蛋白上加个SNAP标签,这个标签可以结合不同的染料,我想让他红他就红,想让他绿他就得绿。真是美的不得了(后来证明是想得美)。然后我就开工做克隆了!PCR!EcoR1!Xhol!InFusion!猛干了一个月,除了那个测序的女人老不来上班耽误我的美梦,其他的还很顺利嘛!结果!这些蛋白真不给面子,要么压根就不表达,要么凶神恶煞的沉淀成一坨,根本不溶解。我变了各种条件,温度,时间,诱导剂浓度。没想到,这些蛋白无比刚烈,软硬不吃。在各种酷刑和诱惑之前毫不动摇,该不表达还不表达,该一坨还一坨!
好吧!我输了!我改变了策略,不加SNAP了,也不臭美了。把原始的最朴素的质粒拿出来,准备纯化。我最信任的老朋友,第一个蛋白,就出了问题。我刚上博士的时候,做的第一个工作,就是纯化这个蛋白,每次都很给力,纯化出都是一堆一堆的。结果,问题就出在他身上。死活不表达。看着那块空白的胶,我感到了来自这个世界的深深恶意。我试了不同的温度,不同的细菌菌株,还怀疑IPTG是不是坏了,自己又新订了一些,最后我还怀疑是不是抗生素太少了,选择压太小质粒都丢了。重新配了所有的buffer,结果还是不表达。我想要是我45°仰望天空,是不是也有泪水划过。。。
骂了娘之后,我重新构建了个质粒,结果终于表达了。其实就是那个老质粒出了问题,但哪儿的问题,我现在还觉得奇怪。放着放着就坏了,真是。。。人与质粒之间最基本的信任呢?
不同结构域的质粒终于好了,蛋白也开始表达了。我想终于走上正轨了。没想到我的噩梦才刚刚开始。
首先是纯化问题。在纯化的过程中,总有降解产物,到最后只剩下一坨GST了。但也有走运的时候。不知道为什么就纯化出来了。什么条件也没变,不要问我为什么。也许有鬼神相助。下一步是要把GST从蛋白上切下去。切不是问题,问题是切下之后还好把GST从蛋白溶液里除掉。在这个溶液里,GST和溶液中的小分子谷胱甘肽如胶似漆,缠缠绵绵。我要做的是,把溶液里的还原型谷胱甘肽透析出去。之后,把蛋白溶液倒到含有谷胱甘肽的柱子上,GST又和谷胱甘肽缠绵在一起,其他蛋白就麻溜的从柱子上流下来了。我用这招做了好多次实验,没有一次失手。没想到!这次却失手了!我重复了好几次,均未果!“这就是失败的滋味么?”三国杀里赵龙死的时候总要说这句话,每次玩儿三国杀,赵龙死了,我觉得他是在说我。我中间又检测了用了几百年的透析膜,此处按下不表。后来我用脱盐柱子,“透析技术哪家强?GE Healthcare找脱盐柱!”在凝胶过滤的过程中,相当于透析了上万次。试了一次,终于成功了,谷胱甘肽被除掉了,结果我的蛋白也降解了。我了个去!不管怎么说,用脱盐柱是能把谷胱甘肽给弄掉。一步一步来。
后来,我用了我们隔壁实验室的一种强大武器,专门破碎细胞用的。我们小破实验室用超声波破碎细胞,会产生很多热。我怀疑是这热会让我的蛋白降解。我找我们实验室的技术员和我一起用隔壁实验室的武器,她哭丧的脸说:“。。。我总不能拒绝你吧。。”她说她宁可绕着我们实验楼裸奔,也不愿意去那个实验室用那个武器。因为管仪器的人非常坏,总喜欢把别人说的一无是处。不怕!我厚着脸皮也要用他们的仪器,要不然我的蛋白都降解成原子了!!!!!其实我们运气挺好的,那个坏人不在了,我们去了几次,都是个好人接待的我们。虽然不是如沐春风,但比裸奔好的多。
吊诡的是,用那个武器之后,我的表达的蛋白彻底消失了,似乎从未来过一样。其实我已经麻木了。要是这个顺顺利利的做完,我自己都不相信。总是要有点差错的嘛!我重复了三次,结果都一样,消失的无影无踪。目前为止,我还不知道是怎么回事。现在我新诱导的细菌在18度里长着。明天早上我再去做一次,看看结果如何。心塞。
转眼,一年就过去了。这就是我的2014年。
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GMT+8, 2024-5-1 11:44
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