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狂犬病的实验室诊断(19)

已有 374 次阅读 2026-5-28 11:55 |个人分类:狂犬病防治|系统分类:科普集锦

狂犬病的实验室诊断(19)

前记:

目前国际上关于狂犬病研究最权威最全面的大型学术专著是《狂犬病：科学基础和管控（RABIES: SCIENTIFIC BASIS OF THE DISEASE AND ITS MANAGEMENT）》，简称《狂犬病(RABIES)》。该书最新版（第４版）已于2020年5月面世。

该书共有22章，其中第12章是《Laboratory diagnosis of rabies(狂犬病的实验室诊断）》。现将此章的内容全文翻译成中文供参考。

第12章狂犬病的实验室诊断(19)

(Laboratory diagnosis of rabies)

4 病毒RNA检测的分子生物学方法(续)

(Molecular methods of viral RNA detection)

4.4 检测丽莎病毒属病毒的实时RT-PCR方法(续)

（Real-time RT-PCRs for lyssavirus detection）

4.4.2 使用嵌入染料的检测方法

（Assays using intercalating dyes）

该方法使用一种DNA嵌入染料（通常是SYBR Green）来检测反应中产生的所有双链DNA（dsDNA）。随着两个PCR引物作用产生扩增子，越来越多的染料嵌入产物中，导致荧光水平不断升高。虽然这对于方法开发来说是一种相对便宜的选择，但需要注意的是，除非反应被精心设计和执行，否则非特异性dsDNA产物的产生可能会导致假阳性结果。为了克服这个潜在问题，还会通过执行熔解曲线分析来计算扩增子的熔解温度（TM），这一过程在大多数用于实时PCR检测的商业仪器中都可以轻松实现自动化。

最初使用这种技术开发的检测方法，通常利用先前RT-PCR方法的试剂，范围从检测丽沙病毒某个亚群（例如，在印度循环的狂犬病毒 (Nagaraj et al., 2006) 或在欧洲的EBLV-1 (Picard-Meyer et al., 2015)）到尝试检测所有已知丽沙病毒的方法 (Hayman, Banyard, et al., 2011; Suin et al., 2014)。其中一些检测方法是两步法方案 (Nagaraj et al., 2006)；确实，Suin等人 (2014) 的方法涉及第一轮标准RT-PCR，随后使用两套内部引物进行实时PCR，并用SYBR Green检测。由Hayman, Banyard, et al. (2011) 开发的泛丽沙病毒检测方法，将先前用于TaqMan检测的两个引物 (JW12 和 N165-146) 适配到SYBR Green化学平台，同时使用熔解曲线分析和扩增子的凝胶分析来确认结果的特异性。这种实时RT-PCR方法比以前描述的用于检测多种丽沙病毒的hnRT-PCR更灵敏 (Hayman, Banyard, et al., 2011)。通过在一管式SYBR检测中使用该引物对，该方法得到了进一步改进，其在整个丽沙病毒属中兼具灵敏度和特异性，并已获验证可用于诊断 (Marston et al., 2019; OIE, 2018b)。典型结果如图12.3所示。

已有文献描述了为寻求更好覆盖特定狂犬病毒变种而对已发表方法进行的修改 (Wang et al., 2014)。确实，对Wakeley等人 (2005) 方法的另一种修改增加了第二个靶向L基因保守区域的检测，以确保诊断的一致性；该方法还描述了涉及两次多重PCR以表征检出的任何丽沙病毒的二次分析 (Fischer et al., 2014)。

还有一种相当不同的策略，同时使用了两种平台类型，描述了一种检测所有丽沙病毒的方法：使用TaqMan方法检测狂犬病毒，并使用SYBR Green检测方法检测所有其他丽沙病毒 (Dacheux et al., 2016)。

(B)