狂犬病的实验室诊断(14)

前记: 

目前国际上关于狂犬病研究最权威最全面的大型学术专著是《狂犬病：科学基础和管控（RABIES: SCIENTIFIC BASIS OF THE DISEASE AND ITS MANAGEMENT）》，简称《狂犬病(RABIES)》。该书最新版（第４版）已于2020年5月面世。

该书共有22章，其中第12章是《Laboratory diagnosis of rabies(狂犬病的实验室诊断）》。现将此章的内容全文翻译成中文供参考。

第12章 狂犬病的实验室诊断(14)

(Laboratory diagnosis of rabies)​

4 病毒RNA检测的分子生物学方法(续)

(Molecular methods of viral RNA detection)

4.3 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法（续）

(Reverse transcription-polymerase chain reaction methods)

4.3.1 引物设计（Primer design）

由于N基因是丽沙病毒基因组中较为保守的区域之一，该基因几乎是所有开发用于狂犬病病毒检测的广谱交叉反应PCR研究的靶标(Le Mercier, Jacob, & Tordo, 1997)，而少数检测方法为此目的则靶向了L基因的保守区域。该领域的许多早期研究旨在扩增该基因相对较长的片段，直至完整的开放阅读框，以便将基因序列与其编码的核蛋白的抗原特性进行直接比较。虽然这些研究强调了PCR用于病毒检测的价值，但它们并未重点关注将该技术用于常规诊断应用，而常规诊断应用在靶向相对较短的序列时得到优化。用于诊断方法的PCR引物设计的限制因素包括：需要适应靶向病毒的遗传多样性，以及将PCR产物（扩增子）的长度限制在几百个碱基对内以优化扩增过程。Fooks等人(2009)提供了用于丽沙病毒RT-PCR检测的各种引物的全面列表，其中一些将在下文描述。

许多研究者已经确定，位于或接近N基因起始密码子的序列是非常有用的引物结合位点（见表12.2），这些序列与靶向邻近序列的引物配对后，已被用于稳健的检测方法开发。引物与其靶标序列之间的少量碱基错配不一定阻止它们的退火。引物退火的严格性取决于退火温度；退火温度越低，退火过程越不严格，能够容纳的错配就越多。然而，需要注意的是，随着退火温度的降低，引物与相关性较低的序列退火的机会增加，并且会发生大量非特异性引物结合。最终，这会导致高度非特异性的反应，作为诊断检测几乎没有价值。错配的位置也会影响它们阻碍引物正确退火的程度；特别是，靠近引物3‘末端的错配通常对PCR高度有害，因为引物的3’末端必须强退火才能启动新的DNA合成。为了克服靶标序列内的变异性，经常采用的一种策略是使用不同序列的引物组合，这些引物可以退火到不同靶标序列内的相同位置。这在JW6/JW10引物集的设计中得到了应用，用于靶向多种丽沙病毒(Heaton et al., 1997)。对该检测方法的后续修改涉及简并引物JW6 UNI和JW10 UNI的设计，其中在每个寡核苷酸的合成过程中，将两个或更多碱基插入到特定位置，从而促进了所有三个系统发育群的丽沙病毒的检测(OIE, 2018b)。现在许多丽沙病毒检测方法都采用简并引物（degenerate primers）以确保广谱覆盖。

表12.2 设计常规用于广谱丽沙病毒RT-PCR检测的详细信息

通过采用具有不同特异性的引物组合，可以更进一步，使得在同一检测中既能检测丽沙病毒，又能鉴定物种或变异株。在英国和欧洲，这种策略已被用于检测和区分狂犬病病毒与欧洲蝙蝠丽沙病毒(Black et al., 2000; Picard-Meyer et al., 2004)。其他几位研究者也描述了基于所产生扩增子大小来识别多种狂犬病病毒变异株的多重PCR方法(Nadin-Davis, Huang, & Wandeler, 1996; Nel, Bingham, Jacobs, & Jaftha, 1998; Rohde, Neill, Clark, & Smith, 1997)。虽然很少有研究比较使用不同RT-PCR方法的结果，但一项使用其他研究者描述的三组引物检测印度狂犬病病毒的研究发现，它们的性能完全一致(Babu, Manoharan, Ramadass, & Chandran, 2012)，从而支持了这些试剂设计的稳健性。

尽管可用于支持靶向编码聚合酶的L基因高度保守区域检测方法开发的序列信息较为有限，但已经设计出能够成功扩增代表多个属的某些弹状病毒该基因片段的引物(Bourhy et al., 2005)，并且靶向该相同保守L基因区域的PCR已被用于非洲和亚洲的人类狂犬病诊断(Dacheux et al., 2008)。大多数常规进行RT-PCR的实验室会保留多种引物组合，并可能应用两对或更多引物对来评估特定标本，同时充分考虑样本来源以及标本可能接触过的病毒。随着丽沙病毒基因组其他部分获得更多的核苷酸序列信息，可能会确定用于广谱交叉反应PCR检测的其他靶标。

（未完待续）

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