限制性内切酶 保护碱基-设计引物之流程

一。使用软件：primer5.0 和oligo7.0,bioxm等、

Cleavage Close to the End of DNA Fragments (linearized vector).pdf

Cleavage Close to the End of DNA Fragments.pdf

二。sense primer:      保护碱基+酶切位点+可能的移码 补加碱基+配对区

  anti-sense primer:保护碱基+酶切位点+(终止密码子 TTA...)+配对区

1,首先在NCBI nucleotide中找到基因序列，确保有起始密码子ATG和终止密码子TAA/TAG /TGA

2，利用软件设计，把基因序列拷贝到软件中，根据要使用的载体，确定合适的酶切位点，（两个酶拥有通用缓冲液）检查sense primer中是否存在移码问题，适量补加碱基，并且使补加的碱基 密码子不是大肠杆菌的稀有密码子。

3，在软件中调整保护碱基 和 补加的碱基，使其退火温度合适，而且两条引物退火温度接近，5度之内

参考： http://www.fermentas.com/cn/support/technical-reference/restriction-enzymes/cleavage-efficiency

链接到fastdigest 公司提供的主要的限制性内切酶的保护碱基个数

 先设计引物，对其退火温度和GC含量评价，完后再加酶切位点就可以了

先设计好引物再加，不影响PCR

引物添加的酶切位点上下游是否需要一致？

这要看目的，

如果你做的双酶切，要求顺序的连接，那么要上下游引物不一样啊，F引物有一个酶切位点，R引物也要有一个；

如果你做的无所谓方向的单酶切反应，那么上下游的引物要一样。

关于引物设计的一楼已经回答，如何添加酶切位点很简单的。就直接在引物前加上就OK了。

比如你的引物是   5-GGGGGAAAATTTTTCCC    CCCTTTTAAATTT-3

酶切位点如果是EcoI的话GGATC（不知道有没有记错，举个例子而已），那么就直接将他加上去就行了5-GGATCGGGGGAAAATTTTTCCC，然后3撇端就加上酶切位点的互补序列就行了（设计的是单酶切？），然后把这段序列拿去合成，然后再去跑PCR，一般得到带有酶切位点的目的基因片段了。