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限制性内切酶 保护碱基-设计引物之流程
一。使用软件:primer5.0 和oligo7.0,bioxm等、
Cleavage Close to the End of DNA Fragments (linearized vector).pdf
Cleavage Close to the End of DNA Fragments.pdf
二。sense primer: 保护碱基+酶切位点+可能的移码 补加碱基+配对区
anti-sense primer:保护碱基+酶切位点+(终止密码子 TTA...)+配对区
1,首先在NCBI nucleotide中找到基因序列,确保有起始密码子ATG和终止密码子TAA/TAG /TGA
2,利用软件设计,把基因序列拷贝到软件中,根据要使用的载体,确定合适的酶切位点,(两个酶拥有通用缓冲液)检查sense primer中是否存在移码问题,适量补加碱基,并且使补加的碱基 密码子不是大肠杆菌的稀有密码子。
3,在软件中调整保护碱基 和 补加的碱基,使其退火温度合适,而且两条引物退火温度接近,5度之内
参考: http://www.fermentas.com/cn/support/technical-reference/restriction-enzymes/cleavage-efficiency
链接到fastdigest 公司提供的主要的限制性内切酶的保护碱基个数
先设计引物,对其退火温度和GC含量评价,完后再加酶切位点就可以了
先设计好引物再加,不影响PCR
引物添加的酶切位点上下游是否需要一致?
这要看目的,
如果你做的双酶切,要求顺序的连接,那么要上下游引物不一样啊,F引物有一个酶切位点,R引物也要有一个;
如果你做的无所谓方向的单酶切反应,那么上下游的引物要一样。
关于引物设计的一楼已经回答,如何添加酶切位点很简单的。就直接在引物前加上就OK了。 比如你的引物是 5-GGGGGAAAATTTTTCCC CCCTTTTAAATTT-3 酶切位点如果是EcoI的话GGATC(不知道有没有记错,举个例子而已),那么就直接将他加上去就行了5-GGATCGGGGGAAAATTTTTCCC,然后3撇端就加上酶切位点的互补序列就行了(设计的是单酶切?),然后把这段序列拿去合成,然后再去跑PCR,一般得到带有酶切位点的目的基因片段了。
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