一项随机、双盲、对照的III期临床试验，用于评估在埃森和萨格疫苗接种程序后，冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)在10-60岁健康受试者中的免疫原性和安全性

摘要

目的:在本文中，我们旨在证明由大连雅立峰生物制药有限公司开发的冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)(研究疫苗)在10-60岁健康受试者中的免疫原性不劣于由辽宁成大生物技术有限公司(中国沈阳)生产的冻干PVRV(阳性对照)，并且其安全性在临床上是可接受的。方法:共有2776名受试者参加了这项研究，并被分为四组:5剂试验组、5剂对照组、4剂试验组和4剂对照组。4剂组(萨格 Zagreb)的患者在第0天(2剂 )、第7天(1剂 )和第21天(1剂 )接种疫苗，5剂组(埃森Essen)的患者在第0天、第3天、第7天、第14天和第28天(各1剂 )接种疫苗。使用RFFIT的狂犬病毒中和抗体试验评估免疫原性，并识别和整理不良事件(AE)和严重不良事件(SAE)。结果:在免疫前抗体阴性参与者中，在接种后第14天和第35/42天，阳性血清转化率达到100%，并且试验组(萨格和埃森接种程序)的阳性血清转化率和几何平均浓度(GMC)不劣于对照组。在接种后的第7天，在第0天使用2剂疫苗的萨格程序的免疫原性优于使用1剂 疫苗的埃森程序，即前者具有更高的血清转化率和RVNA滴度。所有人群、10-18岁和18岁以上人群以及免疫前抗体阳性人群均符合免疫原性的非劣效性标准。两组中所有不良事件、请求性不良事件和非请求性不良事件的发生率均无统计学意义，且未观察到与疫苗接种相关的不良事件结论:所研究的疫苗是安全的，其免疫原性不劣于对照疫苗，且在首剂后7天，萨格程序的效力优于埃森程序。

关键词:

冻干人狂犬病疫苗(Vero细胞); 埃森和萨格程序; 免疫原性; 安全; 非劣性

1.介绍

狂犬病是一种由狂犬病病毒感染引起的人畜共患病，主要在被感染的动物咬伤或抓伤人或舔人的皮肤时传播。狂犬病发现于4000多年前，影响全球150个国家和地区，每年造成全球约86亿美元的损失。据统计，全球每年有近5.9万人死于狂犬病。如今，全球95%的狂犬病病例发生在亚洲和非洲，几乎所有狂犬病患者都是被狗咬伤的。中国是一个面临严重狂犬病威胁的国家。2007年，中国报告了3300例狂犬病病例。在中国，控制狂犬病的有效措施包括加强疫情监测，发布狂犬病暴露处置规范和指南，推动将狂犬病疫苗和被动免疫制剂纳入医疗保险，以及规范城市养犬行为。然而，仍然没有针对狂犬病临床症状的治疗方法，并且死亡实际上是患者出现任何狂犬病临床症状的唯一终点。

狂犬病不同于人类的其他传染病，因为及时有效的狂犬病疫苗接种可以预防其发病，即使在接触病毒后也是如此。在中国，随着狂犬病疫苗免疫接种量的增加，狂犬病发病率从2016年的0.047/10万人下降到2020年的0.014/10万人。基于细胞的狂犬病疫苗，如20世纪80年代中期批准的纯化Vero细胞狂犬病疫苗(PVRV )，已被证明是安全有效的，40多年来为全球数百万人接种了疫苗。此外，与现有PVRVs相关的风险相比，在冻干PVRVs的生产过程中可以避免与使用血清相关的生物安全风险(细菌、真菌、支原体和牛病毒的污染，以及超敏反应的诱导)，这有望提高疫苗接种的安全性并减少不良副作用。冻干PVRVs已在中国成功制造。例如，辽宁成大生物技术有限公司(中国沈阳)和辽宁依生生物制药有限公司(中国沈阳)生产的冻干PVRVs已获得中华人民共和国国家卫生委员会和原国家食品药品监督管理局(SFDA，现国家医药产品管理局(NMPA))的批准，并已在全国各地销售和广泛使用。研究表明，两种疫苗在世卫组织推荐剂量≥2.5 IU/次肌肉注射(IM)时均有效，且诱导的血清狂犬病毒中和抗体(RVNA)浓度≥0.5 IU/mL。

狂犬病疫苗可分为暴露前预防(PrEP)和暴露后预防(PEP) 。根据世卫组织的建议，PEP有两种IM方案:5剂量方案(埃森，1-1-1-1-1)和4剂量方案(萨格，2-1-1) 。根据对其他狂犬病疫苗的研究，这两种方案在安全性和免疫原性方面表现良好。由于萨格程序所需的注射次数较少、成本较低、患者依从性较高以及保护建立较早，因此已广泛用于临床实践。在本研究中，进行了随机、双盲、III期临床试验，以评价由大连雅立峰生物制药有限公司开发和生产的冻干PVRV的安全性和免疫原性，并与在中国广泛使用的辽宁成大生物技术有限公司的冻干PVRV进行了比较。本研究旨在表明研究疫苗的免疫原性不劣于对照疫苗，具有临床可接受的安全性，并且萨格程序的早期(第7天)免疫原性优于埃森程序。该临床试验的目的是为使用冻干疫苗实施萨格程序提供基础。

2.材料和方法

2.1.研究设计

本研究设计为一项随机、盲法、主动对照试验，旨在评估大连雅立峰生物制药有限公司开发的冻干人PVRV在10-60岁人群中经过5剂和4剂程序后的免疫原性和安全性(中国临床试验ID: CTR20200042)。本研究从2020年8月4日(第一位参与者的登记日期)至2021年9月17日(最后一位参与者的最后一次就诊日期)进行，数据在四川省疾病预防控制中心收集。研究开始后，测试方法没有发生重大变化:终点指标没有改变，没有出现中期分析、中断或中止。本次试验的合同研究机构为Simoon Record北京有限公司，血液样本的检测机构为中国食品药品监督管理局。数据管理和统计分析由北京凯捷科技统计咨询有限公司(中国北京)进行。

2.2.研究人群

参与者的资格标准是年龄在10-60岁之间的参与者，具有合法身份证明，自愿同意参与研究并签署知情同意书(参与者或其监护人)，能够理解研究程序并参加所有计划的访视。主要排除标准如下:(1)有狂犬疫苗免疫史或使用抗狂犬病毒被动免疫制剂的受试者；(2)接种首剂疫苗前1年内被狂犬病毒易感动物(如狗、猫)咬伤(伤皮)的参与者；(3)在首次接种疫苗前14天内接种过任何疫苗的参与者；(4)对研究疫苗的任何成分有严重过敏史的参与者，以及任何由疫苗或药物引起的严重副作用的参与者；(5)被诊断为免疫缺陷或在过去3个月内接受过免疫抑制治疗的参与者；(6)入组前3个月接受过血液或血液相关制品的受试者；(7)有惊厥、癫痫、脑病或精神病个人史或家族史的参与者；(8)研究者认为患有任何可能干扰研究目标评估的疾病的参与者。

2.3.随机选择

在这项研究中，计划招募2776名参与者。一位统计学家首先使用SAS统计软件，通过分层块随机化方法随机化2776个序列号。分层因素是血液取样方案(第0、7和35/42天的血液取样，第0、14和35/42天的血液取样)。每层中4剂量试验组(T4)、4剂量对照组(C4)、5剂量试验组(T5)和5剂量对照组(C5)的比例为1:1:1:1。将疫苗样品从原包装中取出，用统一的小盒子重新包装，实现样品盲检。负责随机设计的统计员和相关人员根据随机分配表将研究疫苗或对照疫苗装入每个贴有编号标签的小盒子中，然后将这些疫苗运送到各个试验点。现场研究人员严格分配序列号，以登记的顺序对参与者进行资格审查，然后根据该号码获取并施用相应的疫苗样本。

2.4.盲法

这个试验是按照盲法设计的。疫苗标签由统计员进行盲检后粘贴在疫苗上的指定位置，统计员对盲检信息进行存储并保密。研究人员和受试者在整个试验过程中均处于盲态，受试者和/或其法定监护人、研究人员或参与本研究的任何终点评估、数据审查或数据分析的项目成员均无法获得试验的随机化信息。疫苗接种由不知情的研究人员进行。

2.5.研究疫苗

研究疫苗是由大连雅立峰生物制药有限公司生产的冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)，其通过在生物反应器中接种固定的狂犬病病毒CTN-1V株(固定株)，经过培养、收获、浓缩、病毒灭活、纯化，然后冻干，使用在片状载体上培养的Vero细胞来制备。其活性成分为灭活的狂犬病毒(CTN-1V株)，辅料为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、蔗糖和人血白蛋白。复溶后，每瓶含0.5毫升疫苗，批号为DG201908001。对照疫苗是由辽宁成大生物技术有限公司制造的冻干人狂犬病疫苗(Vero细胞)，其通过在生物反应器中接种固定的狂犬病病毒巴氏杆菌PV2061株(固定株)，在培养、收获、浓缩、病毒灭活、纯化、然后冻干之后，使用在片状载体上培养的Vero细胞来制备。其活性成分是灭活的狂犬病病毒，其赋形剂是氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、人血白蛋白和葡聚糖40。批号为201906167，效力和活性成分与研究疫苗一致。经大连雅立峰生物制药有限公司同步检测，研究疫苗和对照疫苗的效价分别为5.2 IU/剂和5.0 IU/剂。

2.6.样本量

在本研究中，采用递减策略依次评估在T5和C5以及T4和C4接种首剂疫苗后第14天抗体阳性血清转化率和抗体几何平均浓度(GMC)的非劣效性。在单侧α = 0.025的测试水平和功率控制在85%的情况下，发现4组中的每组需要295个病例，总共需要1180个病例。考虑到半数受试者在第一次给药后的第7/14天取样，且退出率约为15%，第二阶段每组的计划样本量为[295/(10.15)]×2 = 694例(“2”代表两种血液取样方案)，4组共计划2776例。

2.7.研究人群、分组和疫苗接种

共有2776名参与者参加了该研究，T4和C4各有694例，他们在第0天接受了2剂 疫苗(试验疫苗或对照疫苗)，在第7天和第21天各接受了1剂 疫苗。此外，T5和C5组中包括694名参与者，他们在第0、3、7、14和28天各接受1剂 疫苗(试验疫苗或对照疫苗)。

2.8.研究终点

2.8.1.主要终点

免疫原性终点:第1剂 疫苗接种后14天，每组中抗体的阳性血清转换率和抗体的GMC。

安全性终点:在每次给药后的0-7天内，引发的不良事件(AE)的发生率，包括疫苗接种部位(局部)AE和非疫苗接种部位(全身)AE；每次给药后0-30天内不请自来的AE的发生率；以及从首次给药到整个免疫疗程后6个月的所有严重不良事件(SAE)的发生率。

2.8.2.次要终点

次要终点是第1剂 疫苗接种后7天所有参与者的抗体阳性血清转换率和抗体GMC，以及全部免疫疗程后14天所有参与者的抗体阳性血清转换率和抗体GMC。

这里，抗体的阳性血清转换率定义为免疫前狂犬病毒中和抗体(RVNA)低于0.5 IU/mL，免疫后RVNA ≥ 0.5 IU/mL的参与者的百分比。免疫前抗体阳性值定义为首次接种前RVNA ≥ 0.5 IU/mL。抗体阴性值定义为首次接种前狂犬病毒中和抗体< 0.5 IU/mL。

2.9.统计分析

免疫原性分析根据按年龄组、免疫前抗体阳性或抗体阴性人群和10-18岁或≥18岁人群分组的方案集(PPS)进行，无校正分析。使用Clopper–Pearson方法计算抗体阳性血清转换率的双侧95% CI，并使用卡方检验/Fisher精确概率方法对组间差异进行统计学检验。对于抗体阳性血清转换率的非劣效性临界值，中和抗体(试验组-对照组)阳性血清转换率差异的较低95% CI应大于5%。对于抗体阳性血清转换率的优势临界值，中和抗体(T4–T5)阳性血清转换率差异的较低95% CI应大于0。使用协方差分析(ANCOVA)和配对t-检验对对数转换后抗体GMC的双侧95% CIs、GMC倍数变化和GMC比率(试验组/对照组)进行统计检验。对于抗体GMC的非劣效性截断值，中和抗体GMC比值(试验组/对照组)的较低95% CI应大于0.67。

使用安全性集合(SS)进行安全性分析。使用MedDRA(版本:24.1，人用药品技术要求国际协调委员会，ICH)对AE和SAE进行医学编码。征集到的不良事件在统计上总结为全身性不良事件和局部不良事件。计算各组所有AE和SAE的病例数和发生率。Fisher精确检验用于确定两个剂量组之间的差异。

统计软件SAS 9.4版(SAS Institute Inc .，Cary，nc，USA)用于所有统计分析。这种差异在统计学上被认为是显著的p < 0.05.

2.10.血清学方法

所有血清样本均由国家食品药品检验所严格按照法规和实验室手册采集，采用快速荧光灶抑制试验(RFFIT)检测狂犬病毒中和抗体。

RFFIT是世卫组织推荐的检测狂犬病毒中和抗体的标准方法。狂犬病病毒CVS株被用作中和血清样品中RVNAs的攻击病毒。含有病毒残余物的易感细胞悬液用于通过荧光抗体染色检测病毒。将固定量的CVS病毒与连续稀释的血清样品(体外中和)一起孵育，然后将其加入易感细胞的悬浮液中。孵育24小时后，用单层丙酮固定细胞，并用荧光标记的抗NP抗体染色，以检测未中和的病毒。通过与病毒对照组比较，计算将固定量CVS病毒的浓度(FFU/毫升)降低50%所需的稀释度，并通过与具有已知效价的参考血清比较，确定每个血清样品中中和抗体的效价。

3.结果

3.1.研究人群

共有2776名受试者参加了该试验，其中2671名受试者完成了试验，105例退出:2例由于严重不良事件，11例由于非严重不良事件，6例由于违反方案，61例由于自愿退出而无任何不良事件，14例由于他们离开了研究中心所在区域，3例由于失访，8例由于其他原因(表1， 附录A， 表A1和表A2).FAS集合包括T5的694名参与者、C5的691名参与者、T4的688名参与者和C4的691名参与者，分组没有变化。此外，每组参与者的年龄、性别、身高和体重在所有参与者中和年龄组之间均匀分布(表2和附录A， 表A3).

表1.登记、完成试验以及纳入每个统计分析数据集中。

 注意:1:所有参与者的血液取样；2:在第三次给药前对50%的参与者进行血液取样，在第四次给药前对另外50%的参与者进行血液取样。FAS:全分析集；SS:安全设置；PPS1:符合方案集1，包括所有接受前两剂疫苗的参与者，在接种疫苗前和第一剂疫苗后7天完成免疫原性血液取样，并具有有效的抗体检测值；PPS2:符合方案的第2组，包括所有接种了前三剂疫苗、在接种疫苗前和第一剂疫苗后14天完成免疫原性血液取样并具有有效抗体检测值的参与者；PPS3:符合方案集3，包括在接种疫苗前和全部免疫疗程后14天完成全部免疫疗程和免疫原性血液取样并具有有效抗体检测值的所有参与者。

表2.研究参与者的人口统计学数据和基线临床特征(FAS)。

3.2.免疫原性

图1a、B分别表示免疫前抗体阴性人群中免疫后中和抗体的阳性血清转换率和GMC水平。结果表明，第1剂 免疫后第7天，T5的阳转率和GMC水平高于C5，T4的阳转率和GMC水平高于C4和T5；T5、C5、T4和C4的RVNA范围分别为(< 0.1，80.8)、(< 0.1，72.4)、(< 0.1，197.4)和(< 0.1，76.2)。

图1.在免疫前抗体阴性人群中，免疫后中和抗体SCR、GMC和GMC倍数发生变化。（A)每组参与者中和抗体的阳性血清转化率。SCR =血清转换率——即免疫后狂犬病毒中和抗体(RVNA) ≥ 0.5 IU/mL的参与者人数占免疫前RVNA < 0.5 IU/mL的参与者总数的百分比；或者免疫后RVNA滴度增加至少4倍的受试者占免疫前RVNA ≥ 0.5 IU/mL受试者总数的百分比。**，p < 0.001. (B)每组参与者中和抗体的GMC水平。几何平均浓度。**，p < 0.001. (C)中和抗体GMC倍数在每组参与者中的变化。**，p < 0.001.

T5、C5、T4和C4的中和抗体阳转率均为100.00%。在第1剂 免疫接种后14天(PPS2)和全程免疫接种后14天(PPS3)，T5和C5之间的阳性血清转换率差异分别为0.00% (95% CI:1.30%，1.28%)和0.00%(95% CI:0.63%，0.66%)，T4和C4之间的差异分别为0.00%(95% CI:1.29%，1.32%)和0.00%(95% CI差异显示阳性血清转换率的所有95%置信区间的下限均大于5%(图1a)。

此外，在第1剂 疫苗接种后14天(PPS2)，血清中的中和抗体GMC水平在T5和T4分别为32.30 IU/mL (95% CI: 29.25 IU/mL，35.68 IU/mL)和30.84 IU/mL (95% CI: 28.08 IU/mL，33.88 IU/mL)，分别比接种前增加了359.84倍和320.46倍；T5、C5、T4和C4的RVNA范围分别为(1.7，1231.5)、(2.6，1231.5)、(3.1，326.4)和(1.5，493)。全程免疫后14天(PPS3)，GMC水平分别为13.97 IU/mL (95% CI: 13.09 IU/mL，14.91 IU/mL)和14.54 IU/mL (95% CI: 13.56 IU/mL，15.58 IU/mL)，分别比免疫前提高了176.51倍和188.73倍(图1b，C)；T5、C5、T4和C4的RVNA范围分别为(1.2，493)、(1.7，333)、(1.7，999)和(0.9，410.5)。

此外，在第1剂 疫苗接种后14天(PPS2)和全程免疫后14天(PPS3)，T5和C5之间的GMC比率分别为1.06 (95% CI: 0.92，1.22)和0.93 (95% CI: 0.85，1.02)，T4和C4之间的GMC比率分别为1.04 (95% CI: 0.91，1.19)和1.00 (95% CI: 0.91

就总人口、10-18岁人口、18岁以上人口和免疫前抗体阴性人口而言，5剂组之间、4剂组之间以及T4和T5之间阳性血清转换率差异的较低95%置信区间均大于5%，GMC比率的较低95%置信区间均大于0.67(附录A， 表A4和表A5).

3.3.安全

表3显示了各组中AE的发生率。结果显示，T4、C4、T5和C5的不良事件发生率分别为36.80%、35.41%、37.52%和34.34%，与疫苗接种相关的不良事件发生率分别为33.77%、31.35%、33.19%和29.44%。此外，在T4，全身性AE的发生率为11.40%，主要表现为头痛(4.33%)，局部AE的发生率为28.72%，主要表现为接种部位疼痛(27.13%)。T5时，全身性AE发生率为12.41%，主要表现为眩晕(3.90%)，局部AE发生率为28.14%，主要表现为接种部位疼痛(26.98%)。除T5的局部不良事件和疼痛发生率略高于C5外，上述不良事件在各组间无统计学差异。此外，未观察到疫苗相关的SAE。

表3.所有参与者的不良事件发生率。

 注:* P1:T5与C5对比；P2:T4与C4的比较：P3:T4和T5的比较。

4.讨论

在本研究中，通过与辽宁成大生物技术有限公司生产的冻干PVRV进行比较，对大连雅立峰生物制药有限公司开发的冻干PVRV在10-60岁人群中的免疫原性和安全性进行了评估。本研究表明，研究疫苗在埃森程序和萨格程序中均不劣于阳性对照疫苗。此外，在接种后不久(第7天)，根据萨格程序施用的研究疫苗的功效优于埃森程序，并且研究疫苗在两种程序中都表现出良好的安全性。

关于免疫原性，替代终点和评估标准在基于RVNA阳性血清转换率和GMC的狂犬病疫苗评估中起着重要作用。在本研究中，根据免疫前抗体阴性人群的免疫原性分析，在第1剂疫苗接种后14天和免疫全程后14天，5剂组和4剂组的抗体阳性血清转换率均为100.00%，这与先前研究中5剂狂犬病疫苗免疫后快速产生保护性抗体的结果一致，显示了这项研究在冻干PVRVs阳性血清转换率方面的可靠性。此外，受试者的GMC在接种疫苗后逐渐升高，并在第14天达到峰值(均大于28.08 IU/mL)，远大于狂犬病疫苗有效保护能力的世卫组织规范(RVNA ≥ 0.5 IU/mL)。在接种后第7天，T4组的GMC超过0.68 IU/mL，高于本研究中T5的0.40 IU/mL。结合本研究中4剂组与5剂组在首剂疫苗接种后14天和免疫全程后相似的GMC数据，我们认为免疫早期4剂量方案优于5剂量方案，这与沈等报道的结论一致。同时，在10-18岁和≥18岁人群之间的亚组分析中，发现属于这两个年龄组的人群在接种研究疫苗后均具有较高的抗体阳性血清转换率和抗体GMC水平，这与李等人的发现相似。然而，与方等人的研究不同，10-18岁和≥18岁人群的阳性率和GMC水平较高。所有这些结果表明，本研究中的研究用冻干PVRV具有良好的免疫原性，不劣于对照疫苗。

在安全性分析方面，各试验组的不良事件发生率与对照组相似，T5的不良事件发生率为37.52%，与沈等报道的36.8%相似。此外，各组之间局部和全身反应的发生率没有显著差异。在本研究中，注射部位的疼痛是最常见的局部症状，而头痛是最常见的全身症状，这与王等人的研究一致，张等，以及Pichon等人。另一种常见的全身不良反应是眩晕，所有病例均在2周内恢复。此外，本研究中未报告疫苗相关的SAE，尤其是之前病例报告中观察到的SAE，如严重过敏反应[22]和急性播散性脑脊髓炎，表明研究疫苗具有良好的安全性。

在这项涉及埃森和萨格疫苗接种程序和对照疫苗的对比临床试验中，对不同年龄组的参与者和免疫前抗体阴性和阳性情况进行了全面调查，并排除了影响疫苗接种结果的多种因素。该临床试验是在健康参与者中进行的模拟暴露研究，在疫苗上市后，可能会监测疫苗在暴露后人群中的疗效。

5.结论

本研究证明，大连雅立峰生物制药有限公司生产的冻干PVRV的免疫原性不劣于辽宁成大生物技术有限公司生产的冻干PVRV，安全性与疫苗相似。此外，与接受埃森疫苗接种程序的组相比，接受萨格疫苗接种程序的组在首剂疫苗接种后7天表现出更高的GMC水平。简而言之，这项研究的结果表明，按照埃森和萨格疫苗接种程序接种的研究疫苗是安全的，具有良好的免疫原性，萨格疫苗接种程序比埃森疫苗接种程序更早产生保护作用，为预防狂犬病提供了一种有价值的替代方法。

Wu X， Li J， Zhou L， Chen J， Jin Z， Meng Q， Chai J， Gao H， Wang Y， Zhao D， Wu H， Yu J， Chen N， Wang Y， Lin Y， Huang P， Li Y， Zhang Y. A Randomized， Double-Blind， Controlled Phase III Clinical Trial to Evaluate the Immunogenicity and Safety of a Lyophilized Human Rabies Vaccine (Vero Cells) in Healthy Participants Aged 10-60 Years Following Essen and Zagreb Vaccination Procedures. Vaccines (Basel). 2023 Aug 1;11(8):1311. doi: 10.3390/vaccines11081311. PMID: 37631879.