针对人血清中狂犬病特异性IgM和IgG的酶联免疫吸附试验的建立和评价

摘要

对狂犬病的免疫力依赖于免疫后诱导的狂犬病毒中和抗体(RVNA)；然而，抗体同种型转换的影响还没有被广泛研究。这与世界卫生组织(WHO)建议的狂犬病疫苗方案的变化特别相关，该方案可能影响RVNA同型动力学，潜在地影响RVNA免疫球蛋白(IgG)水平的峰值和寿命。基于间接ELISA技术，我们开发了快速可靠的测定方法，用于定量人血清中抗狂犬病IgM/IgG类转换。从免疫后第7天到第42天，使用血清中和试验和ELISA IgM/IgG试验，通过每周定量血清滴度来跟踪10名未接种狂犬病疫苗的个体的免疫反应。平均RVNA IU/mL水平为D0 ≤ 0.1，D7 0.24，D14 8.36，D21 12.84，D28 25.74和D42 28.68。狂犬病糖蛋白的特异性IgM抗体水平(EU/mL)较高，平均为D7，1.37，从D14的5.49到D21，6.59。相反，平均IgG抗体(EU/mL)从D28，10.03到D42，14.45占优势。我们得出结论，D28的抗狂犬病IgM/IgG水平表征了同型类转换。这些试验与血清中和试验相结合，根据IgM/IgG反应区分了RVNA水平，预计将增加诊断库，为建立狂犬病疫苗方案(暴露后和暴露前预防)提供额外信息，并有助于研究工作。

关键词:

狂犬病; 酶联免疫吸附测定; 血清中和; 免疫球蛋白同种型; 抗体动力学

1.介绍

一旦出现症状，狂犬病感染几乎100%致命。暴露后预防(PEP)，包括狂犬病疫苗接种系列和狂犬病免疫球蛋白给药(在以前没有接种狂犬病疫苗的人中)，已被证明在预防疾病方面几乎100%有效。世卫组织、世界动物卫生组织(WOAH)和联合国粮食及农业组织(FAO)于2015年发起的“零到30”努力的目标是消除由犬类狂犬病引起的人类狂犬病死亡，这取决于成功的疫苗接种和可靠、易于获得的诊断方法的可用性，以检测和监测接种疫苗的个人和动物的足够保护水平。犬类疫苗接种已被证明是在流行国家从源头控制疾病的最有效方法。在人类中，狂犬病预防需要对暴露于狂犬病的高危人群进行暴露前预防(PrEP)(疫苗接种)，对潜在暴露者进行PEP(疫苗接种和注射狂犬病免疫球蛋白)。

狂犬病准备疫苗接种制度随着时间的推移而变化。目前使用的纯化细胞培养和含胚鸡蛋狂犬病疫苗(使用3剂方案)已显示出具有长期免疫力和效力，并已证明在大范围的年龄组中使用是安全的。两剂方案通过在制备后长达3年的强有力的加强反应产生了RVNA寿命。狂犬病疫苗可以通过肌内(IM)或皮内(ID)途径给药。对于IM，已经确定的是，大于2.5 IU/mL的剂量需要满瓶(从0.5 mL到1 mL)，而通过ID途径仅需要0.1 mL来提供相同的保护水平。世界卫生组织和免疫实践咨询委员会(ACIP)建议在第0天和第7天进行两种疫苗接种(IM或ID) 。

PrEP适用于被认为具有高暴露风险的人群，如实验室工作人员和去狂犬病流行区旅行的人员。在英国进行的研究分析了来自人的狂犬病抗体滴度，并得出结论，早在接种后第四天就可检测到抗狂犬病IgM同种型，早在第七天就鉴定出抗狂犬病IgG同种型。IgG在中和病毒方面最有效，并且在血清中循环时间最长，而IgM不能渗透到组织中并防止狂犬病感染。由于RABV不通过血流传播，而IgM保留在血管循环中，因此在疫苗诱导的狂犬病病毒(RABV)免疫依赖于快速短期保护反应的情况下，短寿命IgM同种型在病毒灭活和消除中的作用可能更有效。在灭活的RABV免疫中，反应是T细胞依赖性的；抗原特异性B细胞被次级淋巴器官边缘的致敏T细胞激活，然后它们作为早期浆细胞和激活的B细胞再循环。活化的B淋巴细胞又通过MHC II(主要组织相容性复合体II)活化T淋巴细胞(CD4+)和辅助性T细胞2型(Th2 )。从IgM到IgG的分类转换通过微环境中产生的分子在分泌免疫球蛋白的B细胞中发生。对于狂犬病，IgM通常被认为是保护性免疫反应中的一个小角色，因此目标是修改疫苗接种计划以驱动对持续IgG产生的反应。通过检测IgG和IgM的金标准RFFIT(基于细胞)测量，初步IgM反应与病毒滴度的早期升高确实相关。Dorfmeier等人的研究表明，基于IgM的狂犬病疫苗在暴露后预防中的潜在实用性，其中快速免疫反应是防止暴露于病毒的关键，表明抗体反应动力学的额外知识可能是有用的。

由于个体对疫苗接种的独特免疫反应，疫苗的有效性在人群中受到挑战。影响个体群体的不同因素是由于内在的宿主因素和外在的疫苗因素。一些内在的宿主因素和医学条件，如HLA类型、妊娠、1型糖尿病、2型糖尿病、慢性感染、癌症和具有妥协或受损的免疫反应，对疫苗接种的效力有影响。

ACIP在2022年更新了PrEP的方案，从三剂量系列改为两剂量系列，类似于目前的世卫组织PrEP建议。缩短的疫苗方案可能影响狂犬病毒中和抗体(RVNA)的峰值水平和免疫球蛋白类动力学。先前的研究表明，产生抗体的浆细胞在两次接种后达到峰值水平；然而，记忆B细胞频率在第三次疫苗接种后增加。关于RVNA同种型转换何时发生的信息可以提供关于在准备后数月/数年的免疫应答中引发足够回忆所需的接种时机和次数的信息，其理由需要长期应答。迄今为止，还没有一种快速可靠的诊断分析来检测和定量RVNA同种型从IgM(主要抗体反应)到IgG的转换动力学，所述转换发生在狂犬病疫苗接种系列期间。狂犬病抗体IgM到IgG类别转换是相关的，因为它提供了关于狂犬病病毒疫苗接种免疫应答的知识，以及对使用当前批准的疫苗的免疫应答的理解，并将指导未来的研究。

2.材料和方法

2.1.血清样本

本研究中使用的血清样本取自10名受试者，按照当时有效的ACIP指南，按照ACIP方案进行暴露前(第0天、第7天、第21天或第28天)接种。在初始(第0天)接种后的第0、7、14、21、28和35天(在一些情况下，还获得了第42天的样品)采集血液。来自未接种受试者的血清库用作狂犬病抗体阴性对照。按照堪萨斯州立大学IRB#9819审查和批准的方案对样本进行去识别。样品在56℃下热灭活30分钟，以去除补体因子，补体因子已被证明会干扰血清中和试验。

2.2.RFFIT血清学试验

使用CVS-11作为攻击病毒株的RFFIT用于测试所有血清样品的基线狂犬病病毒中和抗体(RVNA)滴度值，如前所述。RFFIT分析已在堪萨斯州立大学狂犬病实验室得到验证。简而言之，将100 μL每种血清样品在96孔微量培养板中连续稀释5倍，并将100 μL每种血清稀释液加载到8孔Lab-Tek室载玻片(Nunc Lab-Tek室载玻片系统，目录号177445)中，随后加入100μL浓度为50 TCID₅₀的攻击病毒(ATCC，产品代码VR 959)。得到的系列稀释度代表1:5、1:25、1:125和1:625的血清稀释度。经过90分钟的培养期，样品中的任何RVNA都可以中和病毒，然后加入200 μL经DEAE处理的BHK-21 [C-13]细胞(ATCC，产品代码CCL-10 (5 × 10⁵/mL )，然后培养24小时。通过用FITC结合的抗狂犬病抗体(美国马萨诸塞州伯灵顿的密理博公司，产品代码5500)对丙酮固定的载玻片进行染色，在荧光显微镜下检测残余病毒。使用用于终点滴度的Reed和Muench公式将病毒检测域的计数转化为IU/mL结果，并将滴度结果与在样品旁边测试的国际RVNA标准样品滴度进行比较。将高效价血清在细胞培养基中预稀释，以在方法验证定义的检测线性范围(0.1 IU/mL至15.0 IU/mL)内获得可读结果。

2.3.间接ELISA血清学检测

普拉特利亚T狂犬病II试剂盒(Marnes-la-Coquette，France，3551180)是一种间接ELISA，使用狂犬病糖蛋白作为包被孔的抗原和蛋白A-过氧化物酶缀合物，以下称为蛋白A ELISA。它用于体外检测和滴定人血清和血浆中的抗狂犬病病毒糖蛋白IgG，并按照制造商的说明使用，如前所述。用Bio-Tek ELx808酶标仪(Winooski，VT，USA)测量光密度(OD)读数。EU/mL值根据试剂盒说明和提供的计算电子表格进行计算，包括将样品光密度(OD)读数与试剂盒中提供的阳性标准品的标准曲线进行比较(范围:0.125至4 EU/mL)。初始测试结果高于4 EU/mL的血清样本在试剂盒稀释剂中预稀释，以获得检测线性范围内的可读结果。蛋白A ELISA试剂盒已经在堪萨斯州立大学狂犬病实验室得到验证。

2.4.人抗狂犬病IgM和IgG ELISA检测方法的建立

对蛋白A ELISA进行了改进，用于检测狂犬病特异性人IgM和IgG抗体。间接ELISA二级(检测)抗体由与辣根过氧化物酶(HRP)结合的抗人IgG(适马，圣路易斯，密苏里州，美国，产品代码A0170)和抗人IgM抗体(适马，产品代码A6907)组成，分别用于检测IgG和IgM，替代试剂盒的过氧化物酶-蛋白a。已知狂犬病抗体水平的内标和阴性质控品包含在每个ELISA板上，以评估分析间的精确度。为高滴度血清制备样品稀释液，以使抗体水平在检测范围内(IgG为0.625至20 EU/mL，IgM为0.250 EU/mL至8.0 EU/mL)。根据与Bio-Rad专有标准曲线分析方法(Bio-Rad Platelia Kit提供的电子表格，法国Marnes-la-Coquette)的最紧密拟合，选择Gen5软件中的非线性曲线拟合标准曲线进行OD读数分析(来自可用的Gen5标准曲线分析类型)。初始测试结果高于确定的检测上限的样本在蛋白A ELISA试剂盒稀释剂中预稀释，以获得检测线性范围内的可读结果。

2.4.1.狂犬病抗IgG ELISA的研制

在第21天或之后抽取的受试者血清样品在蛋白A ELISA中进行筛选，以选择具有高EU/mL结果的样品作为抗狂犬病人IgG抗体对照，以及蛋白A ELISA试剂盒对照样品(4.0 EU/mL)。此外，将蛋白A ELISA值为20 EU/mL的抗狂犬病IgG内部对照样品(RIgG)连续稀释以制备标准曲线。抗人IgG-HRP结合物的系列2倍稀释物(1:1600至1:100，000)用于鉴定产生针对蛋白A ELISA的可比结果所需的IgG-HRP结合物稀释物。包括没有狂犬病抗体的样品(阴性对照)以证明缀合物对狂犬病抗体的特异性。进行了线性、准确度和精密度测试。Gen5用于构建标准曲线和样品数据的插值。

2.4.2.狂犬病抗IgM ELISA的研制

通过RFFIT测试筛选接种后第7、14和21天抽取的受试者样品，以鉴定具有高RVNA滴度的样品，即具有RVNA IgM和/或IgG的样品。然后，通过蛋白A ELISA筛选样品，以鉴定具有低蛋白A ELISA滴度的样品，即具有低IgG结合抗体的样品。筛选的血清样本用作ELISA开发的检测阳性对照。棋盘实验用于优化抗人IgM-HRP结合物测定稀释度。样品和抗-IgM-HRP缀合物以两倍系列稀释(1∶2至1∶64)用于对抗-IgM缀合物的两倍系列稀释，以鉴定目标缀合物稀释，随后进行优化实验以建立标准曲线。测试没有狂犬病抗体的样品(阴性对照)以确保抗IgM-HRP缀合物的特异性；在评估的结合物稀释液中没有发现背景反应性。进行了线性、准确度和精密度测试。Gen5用于构建标准曲线和样品数据的插值。

2.5.统计方法

使用graph pad Prism 9 . 5 . 0版和Gen5软件构建和评估标准曲线。计算变异系数(%)，以描述测量的同型滴度内的变异性水平，并确定分析精度。CV%通过标准偏差/平均值乘以100的公式计算，而回收率%(%R)通过实际EU/mL/预期EU/mL乘以100的公式计算。

3.结果

所有受试者血清样本(来自第0、14、21、28和42天)均使用RFFIT、蛋白A ELISA和开发的IgG和IgM ELISAs进行检测，参见S1补充数据表对于个人结果和表S2疫苗接种后平均每天2个标准差(DPV)。

3.1.IgG测定

最接近的标准曲线拟合是使用1∶4800的IgG-HRP结合物稀释液对两倍系列稀释的RIgG内部对照样品(图1)。通过IgG ELISA获得的RIgG内部质控品样本结果与蛋白A ELISA进行比较，指导了曲线拟合的识别。可测量的范围是0.625到20 EU/mL。

图1.使用抗人IgG-HRP缀合物的经鉴定的最佳稀释度构建IgG标准曲线，以测量RIgG内标物的系列两倍稀释度的OD值(20 EU/mL每蛋白A ELISA)；EU/mL值通过Gen5软件使用非线性曲线拟合标准曲线分析来计算。

所有受试者血清样本(来自第0、14、21、28和42天)都在开发的IgG ELISA中进行了测试，参见S1补充数据表对于个人结果和表S2疫苗接种后平均每天2个标准差(DPV)。通过测试三个IgG阳性样品来确定检测的线性和准确性:高(RAE-10)、中(RAE-27)和低(RAE-16) EU/mL值，稀释两倍(精确到1:128)。对于线性，绘制EU/mL值，R2数值是在Excel中计算的；其余的2三个样品的值(高、中和低EU/mL值)分别为0.98、0.94和0.97。为了准确起见，对于高、中和低IgG阳性样品，测得的EU/mL相对于预期值(蛋白A ELISA结果)的%回收率(%R)分别为85.77%、113.12%和52.94%。通过计算三个样品重复结果的CV%确定的分析精度范围为5.24%至7.76%。

3.2.IgM检测

具有最高RFFIT和低蛋白A ELISA试剂盒结果的10个血清样品中的4个被选作IgM对照样品。IgM阳性对照样品在IgM ELISA中一式两份进行测试，使用稀释的IgM-HRP结合物，从IgM-HRP制造商推荐的1:10，000稀释度开始。观察到较高浓度(较低稀释度)的IgM-HRP缀合物将最低稀释度样品的OD读数提高到约1.8，同时保持良好的曲线拟合，这导致用两倍系列稀释的样品RAE-21(根据RFFIT结果估计约为8.0 EU/mL)进行较低IgM-HRP稀释度的实验，参见图2。IgM-HRP 1:1000结合物稀释提供了良好的曲线拟合，并允许IgM阳性对照达到最佳od读数，接近4.0，以允许构建标准曲线，并被选择用于IgM ELISA，可测量范围为0.250至8.0 EU/mL。

图2.抗人IgM-HRP结合物在1:1000至1:10，800的稀释度范围内，针对样品RAE-21(根据RFFIT结果估计约为8 EU/mL)进行了连续两倍稀释的测试，以确定IgM ELISA的最佳浓度。

使用IgM ELISA对所有受试者血清样本(来自第0、14、21、28和42天)进行检测，参见S1补充数据表。通过检测三个IgM阳性样品(高(RAE-21)、中(RAE-4)和低(RAE-15) EU/mL值)的两倍稀释度(精确到1:128)来确定检测的线性和准确性。对于线性，绘制EU/mL值，R2计算了值；其余的2三个样本的结果值分别为0.95、0.99和0.96。通过计算三个样品重复结果的CV%确定的分析精度范围为3.83%至13.28%。由于没有经过验证的狂犬病IgM参考检测，因此无法确定准确性。

3.3.IgM与IgG ELISA比率

IgM与IgG的比率，使用每个检测中所有受试者的EU/mL平均值，以RFFIT检测的平均值(IU/mL)显示(图3)，说明IgM是狂犬病疫苗接种后产生的第一个Ig，早在疫苗接种后7天。对于大多数受试者来说，在接种疫苗后第7天至第21天的中位采样期间，IgM水平升高。表1显示疫苗接受者之间的单个IgM/IgG类转换变异，主要是在初次接种后第21至28天的疫苗接受者之间。通过比较三名受试者的狂犬病抗体动力学可以看出，对PrEP的初始反应存在显著的个体差异，参见图4。与组合的IgM和IgG反应相比，受试者1具有较高的RVNA反应，而受试者6具有较低的RVNA反应，正如IgM和IgG反应所预期的；受试者3也有可从IgM和IgG水平预测的RVNA反应。看见补充数据图S1所有的个体反应图。

表1.接种疫苗后每天每位疫苗接种者的IgM/IgG EU/mL比率(百分比)(DPV)。

灰色阴影表示该时间点没有可用的样本。

图3.RVNA同种型转换动力学显示为接种后每天的平均结果(黑色柱= IgM，洋红色柱= IgG，灰色线= RFFIT)。注:试验中第0天的抗体活性表示为≤值(非零值)。

图4.在三名受试者中证明了制备后狂犬病抗体动力学的个体差异，1名受试者(a)，6英寸面板(b)，以及3英寸面板(c).IgM ELISA结果为黑色，IgG ELISA结果为堆积条中的洋红色，RVNA (RFFIT)结果为灰色线。

3.4.RVNA同型转换动力学

IgM是在疫苗诱导的免疫应答的早期阶段，即疫苗接种后第7-21天(图3和表1)。初次接种狂犬病毒疫苗后28-42天，IgG反应占优势。类别转换在第21天和第28天之间是明显的。此后，随着初始狂犬病疫苗接种后天数的增加，IgM/IgG比率降低。通过RFFIT测量，在初始接种后0至21天，IgM和IgG狂犬病特异性抗体的组合活性有助于RVNA中和能力。第21–28天完全形成的IgG反应，参见图3与IgM相比，与更强的狂犬病中和(RFFIT)和更低量的IgG抗体相关，说明由于对这些高度中和的IgG抗体的选择和克隆扩增，亲和力成熟。

4.讨论

人们早就知道，狂犬病抗体，特别是中和抗体，在对狂犬病病毒感染的免疫中是至关重要的。较少研究的是抗体类别转换动力学在这种保护作用中的作用。从IgM到IgG的分类转换通过分泌免疫球蛋白的B细胞快速发生，这暗示了IgM在由于接种疫苗引起的保护性免疫反应中是一个小角色的想法。对PEP疫苗接种的抗体反应以初步IgM反应为特征，滴度的升高与狂犬病暴露和感染后病毒滴度的早期升高在时间上相关。Dorfmeier等人在小鼠研究中显示了基于IgM的狂犬病疫苗在暴露后预防中的有效性，其中快速免疫反应是防止暴露于病毒的关键。表征对狂犬病疫苗接种的IgM和IgG反应的典型时间可以提供疫苗方案、疫苗类型和PEP类型(例如，多克隆对单克隆)的改变的影响的知识。

本研究中确定的狂犬病抗体动力学与已发表的针对人类病毒和细菌感染的抗体反应研究相似。在轮状病毒感染中，IgM在早期收集的血清样品中达到峰值，在感染后期样品中降至低水平，而IgG在后期出现，这与我们对狂犬病疫苗接种反应的研究结果相似。通过ELISA获得的戊型肝炎病毒的抗体动力学显示了IgM快速增加并血清转化为IgG的典型模式。已使用酶免疫测定法检测针对EP stein-Barr病毒的IgG，并显示出相同的趋势，即在新感染患者中检测到低IgG，而在病毒再激活或先前暴露于病毒的人群中检测到高IgG。IgM和IgG在再激活和初始感染后同时被检测到，其在初次感染或接种疫苗后加强剂量时遵循相同的狂犬病免疫趋势。尽管在早期感染中IgM和IgG的共存方面有一些混合的发现苍白密螺旋体感染导致梅毒，很明显IgM只存在于早期感染中，而IgG是在晚期感染中检测到的主要免疫球蛋白。ELISA(或类似的免疫测定)是每个实施例中确定IgM对IgG反应的选择方法。这种方法是定量的，从校准的读数器中给出客观值，比类似的体外方法劳动强度小，并且已经证明具有良好的特异性和敏感性。

目前使用的纯化细胞培养和鸡胚狂犬病疫苗可提供长期免疫和效力，并已被证明可安全用于大范围的年龄组。这些药物可以通过肌内(IM)或皮内(ID)途径给药。迄今为止，狂犬病疫苗效力的大部分知识已从PEP临床试验研究中获得。PrEP免疫原性来自于对初始反应的研究和临床试验，但关于抗体反应的持久性的公开数据有限。研究表明，抗体反应存在个体差异，包括高、中和低反应者，其实际重要性只能从动物研究中推断出来。

通过利用各种验证参数来评估ELISA方法在检测人血清中狂犬病特异性IgG和IgM中的用途，方法条件得到优化，以测量每个样品的IgG和IgM浓度，并准确确定对狂犬病疫苗接种的免疫反应的抗体同型动力学。对每个个体对疫苗接种反应的免疫反应的研究有助于进一步理解个体之间免疫球蛋白类别转换的可变性，以及该类别从IgM转换到中和IgG的具体时间，通过淋巴组织中对这些最适合的免疫细胞的亲和力成熟的克隆扩增。这项研究的一个局限是样本量小；然而，这些结果是能够准确预测高应答者对低应答者的有效免疫防御的起点，并可能识别与寿命相关的狂犬病抗体发展的动力学，以更好地对个体的狂犬病保护状态进行分类。这些数据还将有助于指导未来预防和治疗方案的研究，以及指导抗狂犬病免疫检测的进一步发展。

未来的改进，如增加受试者人数，将有助于确定不合格患者样本的趋势，如从单个患者收集的RAE-55至RAE-57样本在采样日均显示较低的滴定值。从这些受试者收集数据后，可以进行进一步的测试和分析，以研究免疫反应中的其他生物因素，例如细胞因子，从而扩展我们对狂犬病疫苗接种的非典型反应的知识。这一认识将推动更有效疫苗或疫苗计划的进一步研究和开发。此外，建立合格狂犬病IgM参考血清的进一步工作将提高狂犬病IgM检测的标准化，从而提高准确性。在高通量自动化ELISA系统中验证IgM/IgG ELISA也将提供实际的有用性并增加这些测定的可及性。

正如所证明的，使用抗IgM或抗IgG二级结合物与适当的标准曲线样本配对的改良狂犬病酶免疫吸附测定法(ELISAs)是定量的，从酶标仪获得客观值，并显示出与参考蛋白A ELISA相似的特异性和敏感性。对程序步骤和测试条件进行了优化，以便有把握地检测每个样本的IgM和IgG浓度，并准确确定狂犬病疫苗接种的免疫反应动力学。狂犬病抗体IgM到IgG类别转换是相关的，因为它提供了对狂犬病疫苗接种的抗体反应的知识，特别是同型动力学。了解目前和未来对不同狂犬病疫苗方案和疫苗类型的免疫反应，将有助于随着“2030 零死亡”努力的进展，建立有效的疫苗计划和管理。

Zajac MD， Ortega MT， Moore SM. Development and Evaluation of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Targeting Rabies-Specific IgM and IgG in Human Sera. Viruses. 2023 Mar 29;15(4):874. doi: 10.3390/v15040874. PMID: 37112853.