一起人与患狂犬病的蜜獾咬伤接触的病例报告

摘要

在南非，狂犬病周期由家养和野生宿主物种维持。尽管大多数人类狂犬病病例与狗咬伤接触有关，但野生动物物种可能会将狂犬病病毒(RABV)感染传播给人类。2021年7月，一只蜜獾(Mellivora capensis)在一个小农场咬了一只狗。第二天，同一只蜜獾袭击了该地区的三名成年人，其中一名受害者需要住院治疗。蜜獾随后被射杀，尸体提交给农业研究委员会-翁德斯波特兽医研究所(ARC-OVR)进行RABV诊断。确认了阳性狂犬病诊断，并且狂犬病病毒的扩增糖蛋白基因的系统发育分析证明该病毒是狗源的。

关键词:

狂犬病; 狂犬病病毒属; 蜜獾; 野生动植物; 人类

1.介绍

狂犬病病毒(RABV)是一种被忽视的脑炎疾病的病原体，每年导致约59，000人死亡，主要在亚洲和非洲资源有限的地区。狂犬病病毒的原型物种狂犬病病毒属(弹状病毒科家庭，秩序单阴性病毒)，在全球范围内与该疾病的公共健康危害相关，占至少95%的狗介导的人类狂犬病死亡。这狂犬病病毒该属由17种病毒组成，根据生物学和遗传学特征，该属的成员被划分为三个不同的类群(ⅰ、ⅱ和ⅲ)。Kotalahti蝙蝠lyssavirus (KBLV)，一种在布氏蝙蝠(布氏鼠耳蝠)在芬兰，和Matlo蝙蝠lyssavirus从一只出生不久的长手指蝙蝠的大脑中恢复出来(Miniopterus natalensis)都在等待国际病毒分类学委员会的正式认可。

RABV具有单一的非节段负链RNA基因组，编码五种病毒蛋白的信息，这些蛋白是核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白(L)。其中，G是病毒包膜的一种成分，有助于病毒附着于宿主细胞表面、受体结合和膜融合。此外，G还影响病毒的致病性和嗜神经性，诱导病毒中和抗体的产生。因此，G蛋白是决定RABV进入和适应宿主的关键。

在南非，狂犬病在家养(城市)和野生动物宿主物种(森林)中都存在。家犬(家犬)是狂犬病的宿主和主要病媒物种，并通过它们与野生动物物种的相互作用[(黑背豺(中胚层犬)和蝙蝠耳狐狸(Otocyon megalotis)]维护并轻松更换犬科狂犬病变体。跨物种传播事件(CSTEs)是常见的，并导致家犬RABVs和野生动物宿主物种之间的交换。野生动物宿主物种在CSTEs中对该疾病的公共健康危害的作用和具体贡献尚未完全阐明。狗狂犬病变种最初于20世纪40年代末引入该次区域(显然来自安哥拉)；现在，它在野生动物宿主物种中得到充分证实，证实了这种狂犬病病毒变体的机会主义性质。证明了99%的人类狂犬病病例(n= 105)与狗的接触有关。在这项研究中，我们使用家犬和野生动物宿主(蜜獾和黑背豺物种)糖蛋白的部分区域和G-L基因间区域重建了系统发育历史，并发现野生动物和家犬(狗)的RABVs属于一个不同的簇。这些发现不仅强调了犬狂犬病在疾病流行病学中的重要性，而且对南非狂犬病流行区的控制也有意义。

2.材料和方法

2.1.标本和狂犬病测试

Kromdraai地区(豪登省)有许多野生动物养殖场，已知这些养殖场受到豺狂犬病的影响，随后蔓延到该地区的家犬和牲畜。2021年7月25日，在Kromdraai地区观察到一只蜜獾咬了农场里的一只狗。这个地区位于人类的摇篮，是“人类的摇篮”内的一个国家遗产遗址。第二天，该蜜獾袭击了该地区的三名妇女，导致其中一人因重伤住院治疗。所有受害者都接受了及时的暴露后狂犬病预防，包括伤口浸润和人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)和狂犬病疫苗，但住院患者因伤势过重死亡。邻近房产的所有者射杀了蜜獾，尸体被提交给农业研究委员会-翁德斯波特兽医研究所(ARC-OVR)进行狂犬病测试。

蜜獾的尸体于2021年7月27日提交给ARC-OVR进行狂犬病测试，样本被分配了一个实验室参考号(192/21)(表1包含蜜獾和这里分析的家养和野生狂犬病病毒的流行病学信息)。使用金标准直接荧光抗体测试(DFA)提取适当的脑部分用于狂犬病测试。制备复合涂片，与阳性和阴性对照一起，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的多克隆抗体制剂(Onderstepoort，Pretoria，South Africa)对涂片进行染色，如前所述。在两次PBS洗涤(在0.1 M，pH 7.2-7.4中)并用伊文思蓝(适马-奥尔德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)反染色后，由两名有经验的分析师在紫外荧光(蔡司，柏林，德国)下检查载玻片。结果记录为阳性(从+1(存在于涂片视野的25%中的丽莎病毒抗原)到+4(存在于视野的100%中的丽莎病毒抗原),在没有任何荧光病毒颗粒的情况下记录为阴性。

表1.本研究中描述的狂犬病病毒的流行病学信息。

2.2.抗原分型

使用一组16种鼠抗丽莎病毒核衣壳单克隆抗体(mAbs)对从蜜獾(#192/21)中回收的丽莎病毒进行单克隆抗体分型，并与来自与蜜獾RABV相同地理位置的家养和黑背豺物种的其他丽莎病毒进行比较(表2)。抗-N单克隆抗体由Christine-Fehlner Gardiner博士(加拿大渥太华加拿大食品检验局狂犬病专家中心主任)慷慨捐赠。这组单克隆抗体包括14种抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体、作为阴性对照的抗人5型腺病毒单克隆抗体(1C5)和阳性对照(38HF2)。该组是抗N单克隆抗体，可以区分南非狂犬病病毒和变异体。每种单克隆抗体的反应性记录为阳性(从1到3)或阴性(以产生每种狂犬病病毒的总体染色模式)。

表2.这里分析并展示了RABVs的反应性模式。所有RABVs都表现出犬科狂犬病生物型或犬变种的典型反应模式。

-，无反应性；++，抗原在每个视野中可见，但未感染的区域可见；++ ++在每个显微镜视野中可见大量抗原。

2.3.总RNA提取、逆转录PCR (RT-PCR)、核苷酸测序和系统发育树重建

从大约100 ng的蜜獾和从家养(狗)中回收的其它本地RABVs的脑感染组织中提取总RNA(n= 2)和黑背豺类(n= 4)(参见表1)使用TriReagentR(美国密苏里州圣路易斯市适马·奥尔德里奇)。使用纳米滴分光光度计对RNA进行定量。

RT–PCR反应中使用了G (+)和L(-)引物。寡核苷酸G (+)和L(-)分别为46655 GAC TTG GGT CTC CCG AAC TGG gg 34687和55205 CAA AGG AGA GTT GAG ATT GTA GTC 35543，由in qaba bio technical Industries(Pty)ltd .(南非比勒陀利亚)以100 nmol浓度合成。使用前，将寡核苷酸在1X TE缓冲液[pH 8.0]中重构至100皮摩尔/升，然后稀释10倍用于cDNA合成和PCR分析。引物未经任何进一步纯化即可使用。G (+)和L(-)引物的退火位置和极性根据巴斯德病毒基因组的指定。

大约1μg RNA用于互补DNA (cDNA)合成。简而言之，根据制造商的指南，使用Superscript IV逆转录酶(Thermo fischer，Waltham，MA，USA)进行cDNA。50 μ L-PCR反应混合物由20皮摩尔正向和反向引物组成，20 mMdNTP混合物，1.5 mM MgCl2、5X Taq DNA聚合酶反应缓冲液、1.25 U Takara Taq DNA聚合酶(Takara，Nojihigash，Japan)、无菌无核酸酶水和2微升cDNA(模板)，并根据前述参数进行热循环。使用旋转柱纯化PCR产物，并使用Sanger的双脱氧链终止测序化学(Inqaba Biotechnologies，Pretoria，South Africa)进行双向测序，以检查测序反应的正确性。

从高度可变糖蛋白和G-L基因间区域产生的扩增子的编辑核苷酸序列在高质量扩增子上进行，在ClustalW 和进化树重建使用邻居连接(NJ)方法。用1000个引导复制验证了重建树的拓扑。70%被认为是支持系统发育分类的临界值。

3.结果

3.1.直接荧光抗体检测和单克隆抗体分型

蜜獾FITC染色涂片在100%的涂片(+4)中在紫外荧光下显示典型的苹果绿荧光颗粒，背景为红色(由于反染色) (图2)。来源于蜜獾的狂犬病病毒显示为典型的犬科RABV，其具有与mAb 32GD12(表2)。

图2.在紫外(UV)荧光(40倍放大)下对蜜獾脑组织进行DFA染色的结果。蓝色箭头指向苹果绿色荧光病毒包涵体(Negri体)。

3.2.RT-PCR、测序和系统发育分析

进行了总RNA提取、逆转录PCR、核苷酸测序和系统发育重建，并提供了预期的结果。NJ和ML树的拓扑是相似的(仅显示了NJ树，图3)。系统发育分析揭示了8个独立的聚类A到H，其bootstrap值分别在73%到100%之间(图3)。A群包括从南非豪登省和西北省获得的病毒。此外，来自蜜獾的病毒分离物与来自家犬(217/21)和黑背豺物种(图3)证明了单一犬科狂犬病变异体容易在家养和野生宿主之间交换(支持这些分类群的分支具有100%的引导值)。此外，来自蜜獾的狂犬病病毒与分别从家犬和黑背豺中获得的病毒具有100%的核苷酸序列同一性。该群集(A)被发现与导致2011年豪登省狂犬病暴发和2016年最近豺狂犬病暴发的谱系不同(图3)。B群由从2011年豪登省暴发的家犬中获得的RABV病毒组成，引导值为94%(图3)。C群包括从莱索托获得的RABV病毒，而D群和E群包括从南非东开普省获得的病毒，除了分别从夸祖鲁-纳塔尔(KZN)省获得的一个分离物。F群由来自莫桑比克的RABV病毒组成，除了来自南非KZN省的一个分离物。G群由来自南非林波波省和邻国津巴布韦共和国的RABV病毒组成，引导值为88%。群G可进一步细分为两个亚群G1和II，其中G1由来自林波波省的病毒组成，亚群G II由来自津巴布韦的病毒和来自莫桑比克的一个分离物组成(图3)。H群包括来自南非西北省黑背豺的RABV病毒(图3)。来自家犬和溢出狂犬病病毒的猫鼬狂犬病病毒56/06被用作外组。

图3.本研究中分析的RABVs的系统发育分析。在分析中使用了592个核苷酸的区域，包括糖蛋白的胞质结构域和RABVs的G-L基因间区域，包括在本研究中，以及其他先前表征的病毒。G-L基因间区域序列的邻接树，说明了来自豪登省Kromdraai地区的犬科狂犬病病毒的遗传关系。将病毒序列与2016年狂犬病爆发的豺病毒序列进行了比较。蜜獾RABV的病毒序列用红色突出显示。水平线与序列之间的进化距离成比例，比例尺代表每个位点的核苷酸取代。

4.讨论

我们进行了这项调查，首先是为了确定从蜜獾身上回收的RABV的来源，其次是为了证明其与该国这一地区历史上家养和野生动物狂犬病循环的关联(如果有的话)。这项调查的结果表明，源自蜜獾的RABV是源自家养(狗)和野生(黑背豺)物种的RABV群的一部分。这突出了犬科狂犬病生物型宿主之间转换的机会主义性质和能力。这种变异以前被证明很容易跨越家养动物(狗)和野生动物宿主(豺和狐蝠)之间的物种界限，最近则是aardwolf(ondersteport记录)。使用系统发育重建，犬科RABV变异体被证明与2011年豪登省西南部犬狂犬病暴发的谱系不同。2010/2011年在豪登省观察到的犬狂犬病疫情是由一只从该国东部沿海狂犬病流行省夸祖鲁/纳塔尔(KZN)进口的感染RABV的狗引起的。

最近，2016年豪登省周边爆发了豺狂犬病疫情与另一种来源于南非西北省豺的RABV基因相似，证实了这种嗜神经病原体的跨界性质。使用高度分歧的糖蛋白和狂犬病病毒G-L基因间区的基因测序，很明显从蜜獾中鉴定的狂犬病病毒与狗狂犬病病毒和来源于黑背豺的RABVs聚集在一起，表明狂犬病病毒在人类/家养动物/野生动物界面的传播和交换容易。此外，这些数据强调，这一特定的狂犬病疫情是最近发生的，不同于同一地区报告的2016年豺狂犬病疫情。很明显，蜜獾RABV感染是狗-野生动物(豺)循环的一部分，目前在人类摇篮中的黑背豺类野生动物中传播。在南部非洲，狂犬病病毒感染(由犬科动物和猫鼬狂犬病生物型引发)此前已在野生动物中得到证实，包括蜜獾。最近在塞内加尔，通过对RABV分离株进行基因测序，证明了一种狗狂犬病变种的宿主转变为蜜獾。

有证据表明RABV宿主转移事件涉及野生动物，如塞内加尔报道的蜜獾。调查通常主要是流行病学性质的，很少强调理解在新宿主宿主体内建立感染所需的病毒分子适应。一项研究]利用全基因组测序方法研究了20世纪末明显发生在土耳其的宿主转移。在这项研究中，作者估计宿主转变为狐狸的日期在一年之内，并在亚一致种群水平上调查了病毒适应。20世纪90年代末，土耳其的狂犬病流行导致RABV在狐狸种群中持续存在。使用贝叶斯推理，这个独立的小组调查了来自土耳其的狐狸和狗感染的狂犬病病毒的脑组织的全基因组序列，并证明了该流行病至少在一年内发生。进一步的分析表明，这次动物流行最有可能是由于宿主从当地感染的家犬转移而来，而不是从土耳其境外引入了一种新的狐狸或狗RABV。口服狂犬病疫苗在控制南非东北部和中部野生动物相关狂犬病方面的潜在效用已经得到证实，尽管需要进行更广泛分布诱饵的广泛研究，以评估其对野生豺狂犬病控制的潜在影响。如果要实现“零到三十”的目标，这种方法对于锁定非洲大陆上的野生或无主狗种群可能是有用的。如果在暴露后的合理时间内没有进行暴露后预防(PEP)管理，RABV感染不可避免地是致命的。在这种情况下，根据世界卫生组织的标准指南处理典型的III类咬伤暴露。因此，没有观察到因PEP故障造成的人员死亡。

5.结论

这项调查的结果表明，消除狗传播的人狂犬病不仅取决于从源头(狗)消除疾病，而且取决于在狂犬病病毒感染的宿主转换的情况下，可能使用口服狂犬病诱饵疫苗的野生动物种群。在人类的摇篮中，使用鸡头的试验可能是黑背豺口服疫苗接种的首选诱饵类型，并且应尝试考虑在大规模活动中在夏季和黄昏放置此类诱饵，以最大限度地减少非目标物种的摄入。口服狂犬病疫苗在控制南非东北部和中部野生动物相关狂犬病方面的潜在效用已经得到证实，尽管需要更广泛分布诱饵的广泛研究来评估其对野生豺狂犬病控制的潜在影响。

Mohale DK, Ngoepe E, Mparamoto M, Blumberg L, Sabeta CT. A Case Report on a Human Bite Contact with a Rabid Honey Badger Mellivora capensis (Kromdraai Area, Cradle of Humankind, South Africa). Trop Med Infect Dis. 2023 Mar 24;8(4):186. doi: 10.3390/tropicalmed8040186. PMID: 37104312.