慢性HCV感染（5）直接作用抗病毒药物（DAAs）治疗的现状与问题

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）慢性感染是一种可导致肝硬化和肝细胞癌（HCC）的肝病（http://blog.sciencenet.cn/blog-526326-1297936.html），常并发肝脏以外的损害（http://blog.sciencenet.cn/blog-526326-1296267.html）。目前尚无疫苗预防，及时抗病毒治疗是改善预后的关键。自2011年起，针对HCV的直接抗病毒（direct-acting antiviral agents, DAAs）药物逐渐上市，通过直接作用HCV的目标靶点清除病毒，开创了HCV治疗的新时代。因此，也使HCV感染成为唯一可以治愈的慢性病毒感染。所谓的持续病毒学反应或应答（sustained virologic response, SVR），是指在完成DAAs治疗后的12周或24周，在血清或血浆中检测不到HCV RNA。显著降低了与主要可逆的肝脏和肝外表现相关的发病率和死亡率（http://blog.sciencenet.cn/blog-526326-1296267.html）。

DAAs 的出现和快速发展使诸多慢性丙型肝炎（CHC）患者受益，尤其是既往聚乙二醇干扰素+利巴韦林（pegylated interferons,PEG- IFN+ ribavirin,RBV，PR）时代被认为是难治的CHC群体，为世界卫生组织提出的2030 年全球消除HCV这一目标提供了可能。

1.  致癌病毒的一般特征

人类肿瘤病毒感染本身不足以直接导致癌症，而病毒感染仅提供部分致癌改变。病毒因素和其他因素（即宿主、环境、时间）的结合通常是癌症发展所必需的（http://blog.sciencenet.cn/blog-526326-1297936.html）。几种常见于人类致癌病毒的病毒特征如下：

（1）肿瘤病毒在环境中无处不在，仅仅感染并不足以导致癌症的发展。例如，尽管慢性HBV/HCV/HDV感染导致肝癌的发生率较高，但并非所有持续感染者都会发生肝癌（图1）。因此，病毒本身不足以导致癌症的发展；

(2）病毒引起的癌症是生物事故，因为肿瘤的形成不是病毒感染的有意结果；

（3）病毒性癌症是在持续感染的情况下出现的，发生在最初接触后的许多年到几十年。肝病毒与宿主共同进化，从而进化出有效的免疫逃避策略，以建立长期感染，如干扰固有干扰素反应、炎症和适应性免疫的病毒蛋白表达；

(4）肿瘤内的大多数病毒残留是非传染性的，肿瘤不允许病毒复制。在转化的肿瘤细胞中通常不产生活性病毒粒子；

(5）所有病毒诱导的癌症都有影响肿瘤发生的非传染性共同因素。宿主因素，如年龄、性别、遗传、环境因素和免疫缺陷与病毒性肝炎相关的肝癌有关；

（6）免疫系统可以起到有害或保护作用，一些病毒相关的癌症随着免疫抑制而增加，而另一些则在慢性炎症期间出现。在病毒性肝炎诱导的肝癌中，宿主的抗病毒免疫反应不能消除病毒感染的细胞，反而引起免疫介导的损伤。这种现象在慢性感染中很明显，在慢性感染中，炎症坏死增殖周期引起的反复肝炎导致活性氧（ROS）的产生，从而促进基因突变、纤维化、肝硬化和HCC（（http://blog.sciencenet.cn/blog-526326-1297936.html））。

图1. HCV诱导的肝癌发生：(A）HCV诱导的肝癌发生过程缓慢，持续20-40年，伴有进行性纤维化，最终导致肝硬化；(B）结构蛋白（核心蛋白、E1、E2）和非结构蛋白（NS2、NS3、NS5A、NS5B）通过氧化应激、增殖、凋亡在肝癌发生中发挥直接或间接作用，慢性炎症、脂质代谢失调和血管生成。DAA目标使用闪电符号表示。ROS：活性氧；EMT：上皮/间质转化（http://blog.sciencenet.cn/blog-526326-1297936.html）。

Hanahan和Weinberg提出的癌症特征将细胞调控的细节分解为促进癌症发展的因素，解释了依赖时间进程来积累致癌突变和获得最终导致癌症的各种特征的多步骤性质。该系统应用于病毒诱导的癌症，可以更好地了解肝炎病毒诱导的细胞过程的改变如何促进HCC的发展（图2），以促进发现HCV相关肝癌的可能途径或干预靶点（图1）。

2.  丙型肝炎病毒史和抗HCV感染的抗病毒治疗

自从DAAs的分子问世以来， HCV感染治疗的前景已经完全改变。目前我国正在努力加紧步入DAAs 时代，自2017 年4 月起先后批准了daclatasvir、asunaprevir、simprevir、sofosbuvir、dasabuvir、ombitasvir 及paritaprevir 等进口药上市。其中asunaprevir、simprevir、paritaprevir 属NS3/4A蛋白酶抑制剂PIs，daclatasvir 及ombitasvir 属NS5A抑制剂，sofosbuvir属NS5B核苷类聚合酶抑制剂，dasabuvir属NS5B 非核苷类聚合酶抑制剂。另外我国首个原研蛋白酶抑制剂danoprevir 也已获批上市。

HCV复制周期（http://blog.sciencenet.cn/blog-526326-1292607.html）和DAAs的作用部位见图1和图3-5。

Fig. 4: The HCV replication cycle and sites of action of direct acting antivirals在细胞表面与受体相互作用（步骤1）后，HCV发生内吞（步骤2），然后进行膜融合，并将含有病毒RNA的核衣壳释放到细胞质中（步骤3）。RNA复制发生在一个称为膜网的专门的隔间中，通过RNA聚合酶（步骤4）。然后，RNA被翻译成产生一个大的多蛋白（步骤5）。NS3/NS4蛋白酶将多蛋白分解为结构成分（包壳和核心）和非结构蛋白，包括NS3/4A蛋白酶、NS5B聚合酶（即能复制HCV RNA的RNA依赖型聚合酶），以及参与HCV复制的多功能NS5A蛋白以及病毒的结构组织（步骤6）及其通过胞外细胞增多释放（步骤7）。目前，已开发出直接作用抗病毒药物（DAAs），以抑制HCV的复制和加工。

DAAs的治疗从根本上改变了慢性HCV感染的自然史（图3和4）。事实上，虽然先前基于,PEG- IFN+ RBV使用的PR方案的特点是持续病毒学应答（SVR）为40–50%，但DAA允许几乎100%的患者出现SVR，无论基因型如何。这一结果在临床上具有极其重要的意义，因为HCV清除有望预防由于慢性肝纤维化的进展以及相关免疫系统失调和慢性全身炎症反应引起的大多数严重并发症。或者说抗病毒治疗后，HCV患者的肝外表现（EHM），特别是冷球蛋白血管炎（CV）可随HCV一起消失（http://blog.sciencenet.cn/blog-526326-1296267.html）。抗HCV感染的抗病毒治疗历史及其概述见图5和图6. DAAs的常用疗法见Virusdisease. 2021 Jun; 32(2): 228–243. 在不同丙型肝炎病毒情况下使用DAAs的持续病毒学反应的益处和缺陷见World J Gastroenterol. 2021 Jun 7;27(21):2771-2783。HCV患者中新批准的DAAs的药物相互作用见Int J Gen Med. 2021 Jan 28;14:289-301. 

Fig. 5. Summary of the hepatitis C virus history and the antiviral treatments against the Hepatitis C virus infection. IFN = Interferon; RBV = Ribavirin; the protease inhibitors are in red (TVR = Telaprevir; BOC = Boceprevir; SMV = Simeprevir; PTV/r = Paritaprevir boosted by ritonavir; GZR = Grazoprevir; G = Glecaprevir; VOX = Voxilaprevir); the polymerase inhibitors NS5B are in yellow (SOF = Sofosbuvir; DSV = Dasabuvir) and the replication complex NS5A inhibitors are in white (LDV = Ledipasvir; DCV = Daclatasvir; EBR = Elabsvir; VEL = Velpatasvir; P = Pibentrasvir).

Fig. 6: History of antiviral therapies for HCV infection在1989年发现HCV之前（图10），排除甲肝和乙型肝炎病毒感染，大多数HCV感染可归因于非甲、非乙型肝炎病毒。在IFN时代，HCV感染者接受IFN、IFN联合RBV或PEG-IFN和RBV治疗。2011年，随着telaprevir（TVR）、boceprevir（BOC）、sofosbuvir（SOF）和simeprevir（SMV）的批准，直接作用抗病毒（DAA）革命开始了，随后是daclatasvir（DCV）和ledipasvir（LDV）。这些早期的DAAs通常与PEG-IFN和RBV联合应用。泛基因组时代标志着两种或三种特异性蛋白酶抑制剂、NS5A抑制剂和/或聚合酶抑制剂的联合应用的可用性，以实现对患者的有效治疗，无论HCV基因型、亚型、病毒载量或患者特征如何。

3.  DAA诱导HCV清除

HCC是HCV相关肝硬化的一个重要并发症，据报道其平均发病率为每年1–4%（图1）。HCC的出现主要与两种情况有关：第一种是肝硬化本身，具有坏死性炎症活动；第二种是免疫监视失败，具有逃逸机制。

无法达到SVR和肝硬化是IFN时代HCV患者发生HCC的独立预后因素。DAAs提供了更好的SVR率。HCV蛋白通过解除对宿主细胞周期检查点的调控和增加免疫介导的氧化应激而发挥直接致癌作用，进而导致肝细胞DNA突变频率增加（图2）。因此，通过DAAs清除HCV和随后减少肝脏坏死性炎症活动应该可以降低发生HCC的风险。DAA诱导HCV清除后益处见图9.

图7展示了HCV感染的先天免疫反应和干预部位。描述了HCV感染时触发IFN信号的先天免疫反应。病毒RNA的存在激活细胞表面、细胞质和内体上的PRR（模式识别受体），并通过PAMP（病原体相关分子模式）帮助启动免疫原性反应。综述了目前抗-HCV治疗药物，如DAAs和宿主靶向药物（HTA），以及它们的作用范围、已知的作用机制和局限性。

图7. HCV的IRES（内部核糖体进入位点）由RNA依赖性PKR（蛋白激酶R）识别，而RIG-I（视黄酸诱导基因I）和另一PRR识别HCV RNA 3'和5'区域序列的独特特征。在RIG-I和PKR识别病毒后，较长的HCV双链RNA中间产物激活内体TLR3（toll样受体3）。激活后，PKR和RIG-I与MAV（线粒体抗病毒信号蛋白，也称为VISA、IPS-1和CARDIF）结合，后者通过Traf6泛素化最终通过JNK途径上调IFN合成并激活NFκB。同时，TLR3信号通过适配器分子IFN-β/TRIF（包含适配器诱导干扰素-β的Toll/IL-1受体结构域）传输。ds-RNA活化蛋白激酶R（PKR）通过磷酸化从而抑制eIF2α（真核延伸起始因子2α亚单位），在宿主抗病毒防御中发挥重要作用。抑制eIF2α可减少细胞mRNA翻译，最终可能导致细胞凋亡。然而，HCV可以通过诱导蛋白激酶R的磷酸化而逃逸，从而使其失活，这可能是HCV持续存在的原因之一。无论哪种方式，由于IRES（内部核糖进入位点）依赖性，PKR诱导的mRNA翻译失速都不会影响病毒蛋白质的合成。HCV也可以通过NS3-4A丝氨酸蛋白酶复合物介导的MAV和TRIF裂解逃避免疫反应。这会阻止受感染肝细胞产生IFN-β。循环树突状细胞和巨噬细胞在肝细胞中被PAMP激活时也被激活以产生IFN反应。最终，在NFκB和JNK途径激活的情况下，分泌IFN，以产生抗病毒状态。红色的停止虚线箭头表示病毒蛋白的干预点，以阻止免疫反应的发生

据报道，DAA治疗后，一些新发HCC迅速发展或早期复发的病例。在慢性HCV感染期间，自然杀伤（NK）细胞表现出异常的功能表型，抗病毒细胞因子的产生减少，细胞毒性增加；然而，DAA治疗迅速降低了它们的细胞毒性功能。有效的DAA治疗也抑制了巨噬细胞/单核细胞的肝内活化。随后是粘膜相关不变T（MAIT）细胞毒性的降低，而细胞因子的产生没有正常化。DAA治疗后NK和MAIT细胞表型的快速变化可能减弱这些细胞对癌细胞的细胞毒性。此外，即使在清除HCV感染后，DAA治疗也不能使调节性T细胞的增加频率正常化。因此，持续增加的调节性T细胞频率可能导致局部免疫抑制环境，阻碍癌细胞的清除。最近的研究描述了在HCC从头发生或复发的情况下，慢性HCV感染患者接受DAA治疗后先天性和适应性免疫应答的变化（图8）。

图8.DAA介导HCV清除后免疫细胞表型的变化。在慢性HCV感染期间，NK细胞表现出异常的功能表型，抗病毒细胞因子的产生减少，细胞毒性增加（表现为NKG2D上调）。DAA治疗可迅速降低其细胞毒性功能。MAIT细胞表现出活化表型，高表达CD69、程序性细胞死亡蛋白（PD）-1和人类白细胞抗原（HLA）-DR。T细胞受体介导的MAIT细胞刺激不会显著促进HCV感染肝脏中IFN-γ的产生，导致MAIT细胞产生IFN-γ的整体缺陷。DAA治疗未能恢复MAIT细胞对T细胞受体刺激的反应。慢性丙型肝炎病毒感染中调节性T（Treg）细胞频率的增加已被充分证明。在清除HCV感染后，DAA治疗不能使调节性T细胞的频率正常化。在DAA治疗结束6个月后，M-MDSC细胞的增加频率没有正常化。

图9. DAAs正在改变抗病毒药物通常只能阻止病毒复制和延缓疾病进展的观点 

4.随着DAAs 应用越来越广泛，也渐露一些问题，值得重视及思考

DAAs正在改变抗病毒药物通常只能阻止病毒复制和延缓疾病进展的观点（图9）。DAAs的出现，解决了IFN时代的大问题——疗效不足和安全性差，但同时也出现了一些新的问题。

（1）DAAs耐药：约1%～15%患者经DAAs 治疗会发生病毒学应答失败，并发现与耐药相关突变有关，耐药相关突变是某些突变刚好发生在药物作用的靶基因上，导致DAAs 敏感性下降。有些耐药相关突变在接受DAAs治疗前就已存在，另外在接受DAAs 治疗过程中，由于药物的选择压力，也可促使病毒产生新的耐药突变。目前资料显示，在DAA治疗失败的人群中，HCV基因型3的患者比例过高。规范化抗HCV 治疗是减少DAAs 耐药发生的前提和基础。因此，耐药相关替代（Resistance associated substitutions，RAS）的鉴定可指导选择最合适的HCV再治疗药物。

（2）DAAs抗HCV的远期疗效：抗HCV 治疗的最终目的是预防肝癌和肝脏相关疾病发生。目前DAAs抗HCV随访时间有限，远期疗效有待进一步评估，对存在高风险尤其是合并肝硬化的患者即使病毒已清除也应定期监测及随访。抗病毒药物对于HCC的负面影响，包括抗病毒药物对HCC发生或复发率的影响，有待进一步观察。鉴于此，有资格通过肝切除或消融进行潜在治疗的HCC患者应推迟DAA治疗。此外，DAA对HCV相关发病率的真正影响，包括肝硬化和HCC等结果，在未来十年左右将不得而知。

（3）HCV/HBV共感染人群使用DAA治疗期间的HBV再激活问题，图9。所有准备接受全口服DAA治疗的慢性HCV患者均应接受HBsAg筛查，并在必要时在启动DAA治疗前开始预防性核苷（酸）类似物抗乙肝治疗。

（4）DAAs是否会抑制免疫系统对肿瘤的监控能力？基于IFN的抗病毒治疗可以降低HCC复发的风险。然而，作为一种不含IFN的方案，DAAs仅发挥抗病毒活性而无免疫反应。慢性感染患者的免疫系统严重失调，有关免疫系统限制治愈患者肝脏病理学的能力的问题仍然存在。经DAA清除HCV的患者免疫功能受损的另一个重要后果是无法产生保护性免疫以防止可能的再次感染，需要再治疗或开发预防性疫苗。

（5）DAAs治疗对主要合并症糖尿病和心血管疾病有益处吗？目前的证据表明，根除HCV可降低心血管疾病和T2DM的发病率和死亡率。

5.  世界卫生组织（WHO）提出的病毒性肝炎消除政策

HCV在世界范围内具有较高的流行率，是一个全球性的人口问题。HCV的历史（图10）以多种组合的泛基因型疗效结束，这就解释了从病毒发现到2016年WHO提出的病毒性肝炎消除政策的短短30年（图11）。DAA彻底改变了慢性HCV感染患者的治疗方法，可能导致WHO认可的到2030年消除HCV。然而，一些属于所谓独特或特殊人群的患者由于未达到持续病毒学反应、潜在药物副作用或相互作用或共病性而被称为难以治疗。此外，在2020-2021年冠状病毒病大流行之后，WHO提倡的到2030年使用DAA抗病毒治疗消除HCV这一成就是不可能实现的。

图10. HCV的发现

 图11. WHO新战略提出了防治病毒性肝炎的全球目标。这包括到2020年，新的HBV和HCV感染病例减少30%，死亡率降低10%

6.小结

我们在《慢性HCV感染（4）诱导肝细胞癌的机制》一文中（http://blog.sciencenet.cn/blog-526326-1297936.html）讨论了病毒诱导的致癌通路和宿主相关通路之间可能存在的重叠协同机制，即HCV感染可通过不同的途径诱发HCC。DAAs改变了HCV治疗现状，可以根除HCV，并由此带来肝脏和肝外表现相关的发病率和死亡率的显著降低。然而，应该强调的是，）DAAs耐药，远期疗效，对HCC发生或复发率的影响以及抑制免疫系统对肿瘤的监控能力等一些问题值得重视及思考。由HCV感染触发的一些生物级联反应，导致DAAs治疗后不依赖病毒的持续HCC风险，就可以独立于病毒的存在而进行，它们不能终止HCV诱导的癌前过程。

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