CRISPR-Cas9作为一种非常有效的基因编辑的工具目前备受瞩目，它已经彻底改变了生命科学，必将在生物技术、农业和医学领域发挥越来越重要的作用。但是它的长期或永久的遗传修饰效应仍然值得关注。特别是以腺相关病毒AAV为载体的基因治疗临床前试验和临床试验中，Cas9将在转染细胞中的长期表达，必须对基因编辑机制的长期效应进行关注。

    韩国汉城国立大学医院临床研究所、韩国汉城国立大学医学院生物医学系的金宗勋团队用针对Hif1a的以AAV为载体的来自空肠弯曲菌的Cas9同源物CjCas9注射入C57BL/6小鼠的玻璃体中，有效地抑制了小鼠视网膜病理性脉络膜新生血管形成，这是年龄相关性黄斑变性（AMD）的主要病理特征之一。研究发现尽管靶基因在视网膜或视网膜色素上皮细胞中的突变频率在45%到79%之间，但组织学和视网膜电图分析显示靶向Hif1a的CjCas9在视网膜中没有引起任何明确的毒性。重要的是，在注射后14个月，用Digenome-seq测序并用Cas-OFFinder算法分析，发现在潜在脱靶位点上没有检测到指标，说明CjCas9的长期表达不会加重脱靶效应。他们的结果表明，玻璃体内注射针对Hif1a的AAV编码的CjCas9能有效地诱导和维持视网膜组织的突变超过1年，并且不影响视网膜组织的完整性或功能。腺相关病毒表达的CjCas9在临床前实验中是安全的。

在视网膜疾病中，除了纠正突变的基因片段，Cas9还可以用于治疗性破坏致病的野生型基因，如血管内皮生长因子(VEGF)、缺氧诱导因子1-α(HIF-1a)和VEGF受体2「1-3」。其中Hif1a即没有高特异性阻断治疗剂也没有靶向药物，更适合CRISPR-Cas9介导的治疗方法。AAV是诱导体内基因编辑的最实用的方法，特别是脑、肝脏和眼睛等器官，而不同血清型的AAV具有不同的组织特异性取向。

金宗勋团队在之前的研究中，在小鼠玻璃体内注射针对Hif1a的AAV编码的CjCas9，发现小鼠视网膜上的Vegfa或Hif1a基因在6周内耗竭，有效地抑制了小鼠视网膜病理性脉络膜新生血管形成。在这个研究中，他们评估了在玻璃体腔注射靶向Hif1a的CjCas9的AAV后14个月小鼠视网膜组织的组织完整性和视网膜神经元的电学特性，发现这个病毒能有效地诱导靶部位的插入和缺失。HOUT可检测到脱靶效应。这些长期观察可能为体内编辑与多种视网膜疾病（包括年龄相关性黄斑变性AMD、Leber先天性黑蒙症和视网膜色素变性）的病理状况相关的选定靶基因提供支持。

图1。小鼠视网膜AAV-CjCas9注射后14个月组织学观察

(A)玻璃体腔注射PBS(无AAV)、AAV-CjCas9:Rosa26和AAV-CjCas9:Hif1a后14个月小鼠视网膜的代表性H&E图像。(B)400倍镜下观察视网膜组织中凋亡细胞的数量(n=6)。误差条表示SEM。(C)玻璃体内注射PBS(无AAV)、AAV-CjCas9:Rosa26和AAV-CjCas9:Hif1a.GCL，神经节细胞层；内核层(INL)；内节(IS)；外核层(ONL)；外节(OS)。刻度：25毫米。

在Leber先天性黑蒙症等视网膜疾病的治疗中，AAV是广泛使用的治疗基因传递平台，并已显示出长期的有效性和安全性「3」。类似地，AAV-CjCas9:Vegfa和Hif1a无论其局部效应如何，均未使受治疗小鼠的体重发生任何变化。尽管如此，人们还是担心与Cas9表达延长相关的脱靶效应增加。在金宗勋团队的研究中，在Hif1a编辑的视网膜细胞和RPE细胞中，在靶位点检测出指数，频率分别为79±2%和45±7%。初始注射后6周至14个月，Cas9编辑的视网膜中Vegfa和Hif1a靶点的indel率增加。显然，考虑到大多数视网膜细胞是终末分化的，连续的Cas9表达导致细胞中额外的双链断裂和indel诱导。尽管在靶位点的indel频率增加，但注射后14个月内没有可检测到的脱靶效应，这表明，由于CjCas9的高特异性，长期表达不会导致体内潜在的非靶位点的indel。

Reference

1. Kim, E., Koo, T., Park, S.W., Kim, D., Kim, K., Cho, H.Y., Song, D.W., Lee, K.J., Jung, M.H., Kim, S., et al. (2017). In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni. Nat. Commun. 8, 14500.

2. Huang, X., Zhou, G., Wu, W., Duan, Y., Ma, G., Song, J., Xiao, R., Vandenberghe, L., Zhang, F., D’Amore, P.A., and Lei, H. (2017). Genome editing abrogates angiogenesis in vivo. Nat. Commun. 8, 112.

3. Kim, K., Park, S.W., Kim, J.H., Lee, S.H., Kim, D., Koo, T., Kim, K.E., Kim, J.H., and Kim, J.S. (2017). Genome surgery using Cas9 ribonucleoproteins for the treatment of age-related macular degeneration. Genome Res. 27, 419–426.

4. Yin, H., Kauffman, K.J., and Anderson, D.G. (2017). Delivery technologies for genome editing. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 387–399.

11. Gao, X., Tao, Y., Lamas, V., Huang, M., Yeh, W.H., Pan, B., Hu, Y.J., Hu, J.H., Thompson, D.B., Shu, Y., et al. (2018). Treatment of autosomal dominant hearing loss by in vivo delivery of genome editing agents. Nature 553, 217–221.

原文链接：

Long-Term Effects of In Vivo Genome Editing in the Mouse Retina Using Campylobacter jejuni Cas9 Expressed via Adeno-Associated Virus.

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001618304982?via%3Dihub