用人工microRNA安全有效的在猴中沉默超氧化物歧化酶1

    肌萎缩性侧索硬化（ALS）是一种由运动神经元变性导致的迅速的进行性的瘫痪的致命的神经疾病。今年10月，麻州大学医学院Horae基因治疗中心的Christian Mueller团队使用编码靶向超氧化物歧化酶1（SOD1）的人工microRNA腺相关病毒（AAV）研究了家族性ALS中普遍突变的基因SOD1的沉默。他们将血清型AAV鞘内输注进食蟹猴（Macaca fascicularis）的脊髓，比较了针对突变SOD1的人工microRNA表达的不同启动子，结果显示SOD1基因在运动神经元中有有效的传递和有效的沉默。表明SOD1的人工microRNA进行基因治疗是安全的，并且值得进一步开发用于治疗SOD1突变连锁ALS。

    家族性ALS约占所有ALS病例的10%，是作为显性性状遗传的。这些病例中大约有20%是由编码胞质Cu/Zn超氧化物歧化酶1(SOD1)的基因突变引起的，现已经鉴定出185个SOD1突变。有多种机制可解释突变SOD1蛋白为什么具有神经毒性，包括突变SOD1通过构象不稳定性、错误折叠和一定程度的聚集获得毒性「1」。之前在成年SOD1G93A小鼠（ALS模型）中，Christian Mueller团队已经证明SOD1沉默可显著延缓疾病的发病和死亡，并显著保持肌肉力量和运动及呼吸功能「2」。

在这个研究中Christian Mueller团队使用了在非人灵长类动物中具有优良的中枢神经系统(CNS)转导和安全特性重组腺相关病毒载体rh.10(rAAVrh.10)，针对多个SOD1突变沉默食蟹猴体内的SOD1，同时还比较了pol II(CB)和pol III(H1和U6)启动子驱动miRNA表达的作用。首先，通过测定每个组织中每个细胞的病毒载体拷贝数并通过免疫染色分析GFP的表达，以研究载体在脊髓、脑和外周器官中的生物分布。其次，用ddPCR和分支FISH（RNAscope）分析在脊髓不同部位（颈、胸、腰）以及激光捕获的运动神经元中SOD1在mRNA水平上的沉默。最后，利用小RNA-seq分析成熟miR-SOD1 (guide strand)的丰度和非靶标效应，分别用NAb法和ELISpot分析AAV衣壳的体液和细胞免疫应答，评价临床载体的安全性。

    SOD1的治疗性沉默已经有很多研究，从临床角度来看，ASO和小干扰RNA的主要缺点之一是患者需要重复给药，而rAAV介导的基因治疗(包括基因转移和基于RNAi的基因沉默)为一次性给药并持续终生的治疗模式。这个研究中一个独特且临床上重要的发现是鞘内载体输送后周边有大量的载体基因组，鉴于AAV的治疗与转导效率的相关性，这些结果表明在这个研究中所开发的策略更有利于SOD1的人工microRNA治疗走向临床。

Reference

1. Prudencio M, Hart PJ, Borchelt DR, Andersen PM. Variation in aggregation propensities among ALS-associated variants of SOD1: correlation to human disease. Hum Mol Genet. 2009 Sep 1;18(17):3217-26.

2. Borel F, Gernoux G, Cardozo B, Metterville JP, Toro Cabrera GC1, Song L, Su Q, Gao GP, Elmallah MK, Brown RH Jr, Mueller C. Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates. Hum Gene Ther. 2016 Jan;27(1):19-31.

文章链接：http://stm.sciencemag.org/content/10/465/eaau6414.short