双AAV载体可恢复耳铁蛋白敲除的耳聋小鼠的快速胞吐和部分听觉功能。

DFNB9型耳聋是由OTOF基因编码耳铁蛋白突变引起的。传入听觉内毛细胞（IHC）的正常听觉和突触传递需要耳铁蛋白，耳铁蛋白在IHC胞吐和囊泡补给中起着重要作用，并且参与囊泡的重建和内吞。OTOF基因突变导致严重的先天性非综合征常染色体隐性耳聋。迄今为止，在OTOF基因中已经鉴定出1000多个致病突变，影响2.3-10%来自不同种族的遗传性非综合征性听力损失患者【1】。鉴于这些患者的内耳形态正常，基因治疗可能优于人工耳蜗植入，在出生后将野生型耳铁蛋白的cDNA转移到内耳可能可以改善这种听力损失。但是由于OTOF基因的大小较大，目前还没有能高效率地通过腺病毒、慢病毒或semliki森林病毒进行电转或病毒感染的方法将cDNA转导到出生后内耳的方法，因此很难进行治疗。

在这个研究中，Sebastian Kuegler和Ellen Reisinger构建了两种腺相关病毒（AAV），每种都含有一半的耳铁蛋白cDNA。将这些双AAV2/6半载体共同注射到6-7天龄的耳铁蛋白敲除小鼠（Otof^-/-）的耳蜗中后，高达50%的IHCs中表达了全长耳铁蛋白。Otof/IHCs的双AAV转导可完全恢复快速胞吐，而去甲肾上腺素腺泡的补给可达到野生型水平的35-50%。声点击诱发听觉脑干反应阈值为40-60分贝。由此，他们认为双AAV载体介导的基因转染可能适合于治疗由OTOF等大基因突变引起的耳聋。

重组腺相关病毒（AAV）是治疗听力损伤的安全而有前途的基因治疗工具。在动物模型中，产前注射AAV到发育中的耳囊或产后耳蜗注射已被证明能有效地转导IHC。然而，大约AAV大约4.7-5kb，只有有限的载货能力，大编码序列（CDS），如6kb长的耳铁蛋白cDNA就很难转运。如果裂解AAV载体，使每个AAV载体都含有一个被转基因的片段，就可以绕过这个问题。Duan D等人这项技术利用了AAV基因组通过末端连接其反向末端重复序列（ITR）形成尾对头连接体的内在能力【2】。在“反式剪接（TS）”策略中，通过将人工剪接供体（SD）和受体（SA）位点引入各自的半载体中，在转录后剪接ITR。在“重叠”裂解AAV策略中，大转基因的重组也可以通过位于第一AAV半载体3’端和第二AAV半载体5’端的重叠序列的同源重组来介导。靶细胞核中全长表达盒的正确重组导致全长mRNA和蛋白的产生。迄今为止，双AAV载体和三AAV载体已证明在光感受器和肌肉细胞中有效，但尚未建立用于IHC。

在Sebastian Kuegler和Ellen Reisinger所构建的双AAV系统中耳铁蛋白双-50 AAV-TS和50 AAV-Hyb半载体均含有人β-肌动蛋白启动子(hbA)、巨细胞病毒增强子(CMVe)、eGFP、诱导核糖体跳跃的P2A肽序列，以及耳铁蛋白编码序列(CDS)的前半部分以及3’端的剪接供体序列。双-30 AAV-TS和30 AAV-Hyb半载体包含5’端的剪接受体序列，和耳铁蛋白CDS的后半部分，以及土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)和牛生长激素多腺苷酸化序列(pA)。双-50 AAV-Hyb和30 AAV-Hyb半载体还包含从SD下游和SA位点上游的F1噬菌体衍生的高度重组序列。将小鼠耳铁蛋白cDNA在外显子21到外显子22的结合部位分成两半，每半包含三个耳铁蛋白C2结构域（C2A-C2C在5’端AAV半载体，C2D-C2F在3’端AAV半载体上）。为了区分耳铁蛋白双AAV cDNA和野生型cDNA，在SA位点下游的耳铁蛋白CDS中引入沉默点突变，产生人工限制位点(AccIII；TCCGGA)。

这个研究通过将耳铁蛋白cDNA分成两半并包装成两株病毒，克服了适合于听觉毛细胞转导的腺相关病毒（AAV）的载货限制。将两种病毒共同注射到耳蜗内可导致内毛细胞的共同转导和全长mRNA和蛋白的重组和表达。尽管从两个AAV半载体中重新评估全长转基因的效率较低，但是耳铁蛋白水平达到了野生型水平的30%。通过治疗性再引入的耳铁蛋白，快速内毛细胞胞胞吐完全恢复，连续囊泡补充部分恢复。在分裂AAV耳铁蛋白治疗后，重度耳聋小鼠的听功能得到部分恢复。

1．Roux I, Safieddine S, Nouvian R, Grati M, Simmler M-C, Bahloul A, Perfettini I, Le Gall M, Rostaing P, Hamard G et al (2006) Otoferlin, defective in a human deafness form, is essential for exocytosis at the auditory ribbon synapse. Cell 127: 277 – 289

2.  Duan D, Sharma P, Yang J, Yue Y, Dudus L, Zhang Y, Fisher KJ, Engelhardt JF (1998) Circular intermediates of recombinant adeno-associated virus have defined structural characteristics responsible for long-term episomal persistence in muscle tissue. J Virol 72: 8568 – 8577

原文链接：

A dual-AAV approach restores fast exocytosis and partially rescues auditory function in deaf otoferlin knock-out mice.

http://embomolmed.embopress.org/content/early/2018/12/03/emmm.201809396.long