该篇论文已发表在《中国调味品》2014年第1期

分子印迹技术在黑木耳功效成分分离中的应用

刘晓艳^1*，杨国力²，于纯淼^1*，陈喜君²

（1.黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨 150040 ；2.黑龙江众生生物工程有限公司菌物药工程技术中心哈尔滨 150090）

摘  要：黑木耳中的功效成分种类多，含量少，采用传统的分离手段富集难度较大。分子印迹技术是一种高选择性快速分离技术，分子印迹聚合物（MIPs）在天然产物中具有良好的应用前景。本文综述了分子印迹技术在黑木耳功效成分中的应用及前景。

关键词：分子印迹技术，黑木耳，功效成分，分离

Application of molecular imprinting technology in the separationof functional componentsfrom Auricularia Auricula

LIU Xiao-yan¹, YANG Guo-li²,YU Chun-miao¹ , CHEN Xi-jun²

(1. Pharmaceutical College, Heilongjiang Universityof Chinese Medicine, Harbin 150090;

2. Engineering Technology ResearchCenter for Fungi Medicine ,Heilongjiang Johnsun Bio-TechCo., Ltd, Harbin150090)

Abstract:functional componentsfrom Auricularia Auricula are in low content and difficult to beenriched by general methods. Molecular imprinting technology(MIT) is promisingin preparing highly selective separation matrixes. Molecularly imprintedpolymers(MIPs) show good prospect in the purification of active ingredientsfrom natural products. In the review, the application of molecular imprintingtechnology in the separation and purification of functional componentsfrom Auricularia Auricula was introduced.

Key words: molecular imprinting technology, Auricularia auricular, functional components, separation

黑木耳[Auricularia auricular(L.exHook.) Underw]属木耳科，木耳属，是我国著名的药食同源真菌，被誉为“素中之荤”和“素中之王”，是珍贵的食用菌之王。黑龙江是中国黑木耳产量及品质最好的地区，年产量达3,000万t，是黑龙江的支柱产业，具有很好的经济和社会效益，其在保健食品方面的应用具有很大的潜力。黑木耳具有丰富的营养成分，包括多糖^[1]、腺苷^[2]、黑色素、麦角甾醇、磷脂类^[3]、氨基酸^[4]及多种维生素等，近年来，在药理学方面的研究表明，这些营养成分具有抗心血管疾病^[5-9]、抗肝损伤^[10,11]及抗肿瘤^[12]等作用。分子印迹技术（molecularimprinting technology，MIT）源于20世纪40年代paulin提出的抗体形成学说^[13]，其为分子印迹理论的产生奠定基础，1993年，瑞典大学的Mosbach等^[14]发表了茶碱分子印迹聚合物的研究结果促进了MIT技术的快速发展。由于MIT具有预定性、识别性、实用性的特点及其高分子共聚物(Molecularly-imprinted polymers, MIPs）具有高度稳定性和使用寿命长的优点，使MIT技术在天然产物功效成分的分离纯化方面具有广泛的应用。本文综述了MIT技术在黑木耳功效成分的提取纯化方面的应用，并展望了其发展前景。

1.      分子印迹技术的基本原理

分子印迹技术是一种通过制备分子印迹聚合物，其对特定目标分子具有较高结合力和选择性，来分离、纯化化合物的仿生技术。MIT的基本原理如图1所示，在一定溶剂中，有适当官能团的功能单体和模板分子以共价或非共价作用形成单体–模板分子复合物，然后通过加入合适的交联剂，经过一系列的反应使复合物与交联剂通过自由基共聚合形成共聚物，使功能单体上的官能团固定下来，最后通过一定的洗脱剂将聚合物中的印迹分子洗脱下来，从而在高分子共聚物中形成一个与模板分子在三维空间上完全匹配，并且含有能与模板分子契合的官能团三维空穴，这个空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别的特性。其中的高分子聚合物即是分子印迹聚合物（Molecularly-imprinting polymers, MIPs），其具有锁匙原理，即象锁一样对钥匙具有选择性，类似于生物的识别系统，对目标产物具有高度选择特性。MIPs的制备是MIT的核心。

分子印迹技术一般具有三大特点^[15]：一是预定性，即可以根据不同的目的和需求制备出不同的MIPs；二是识别专一性，即根据模板分子定做的MIPs可专一的识别印迹分子；三是实用性，即优于酶与底物、抗体与抗原等天然的生物分子识别系统，可以抗恶劣环境，具有高度的稳定性和很长的使用寿命。

图1 分子印迹技术原理

Fig.1 Molecular imprinted technology

2.      分子印迹聚合物的制备方法

制备MIPs的方法与一般聚合方法一致，但在设计MIPs时要注意选择与印迹分子有特异性的单体和合适的交联剂与溶剂^[16]。MIPs制备技术日渐成熟，聚合方法主要有本体聚合，沉淀聚合，悬浮聚合，表面印迹法等，其形态多种多样，已有无定型粉末、整体柱、球形和膜等多种形态。

2.1    本体聚合法

本体聚合技术^[17]是分子印迹聚合物研究中经典的方法，即将印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂按照一定的比例溶解在适当的惰性溶剂中，置于安培瓶中，超声脱气，充氮除氧，在真空的条件下密封，在一定的时间内通过热聚合和光聚合，获得块状聚合物，经粉碎、过筛得到大小适合的微粒，经过索氏抽提洗脱出去印迹分子，真空干燥后备用。此方法获得的MIPs对印迹分子具有良好的选择性和识别特性，实验操作简单，装置简易，便于普及，但是后续处理过程繁杂，费时费力，产量低，大规模生产困难，模板出去困难，成本较高。

2.2    沉淀聚合法

   沉淀聚合法^[18]广泛用于合成分子印迹微球，是指在引发剂的作用下，处于均相的印迹分子，功能单体，交联剂相互反应，形成线形和分支的低聚物，接着低聚物通过交联成核从介质中析出，并相互聚集形成聚合物粒子，最终通过不断积累低聚物和单体形成高交联的微球状聚合物。

2.3    悬浮聚合法

悬浮聚合法是Mayes^[19]等提出的制备球形分子印迹聚合物的一种常用方法，其反应体系是由单体，引发剂，分散剂和水组成的，即用与一般有机溶剂皆不互溶的全氟烃为分散介质，加入特制的聚合物表面活性剂，通过高速搅拌获得乳浊液，然后加入引发剂，聚合后得到粒度范围分布窄，形态规则的MIPs微球。

2.4    表面印迹法

表面印迹法^[17]是一种起源于硅胶表面处理和衍生，在固体表面进行分子印迹聚合的技术。即先将模板分子与功能单体在有机溶剂中反应形成加合物，然后将其与表面火化后的硅胶、玻璃介质和聚三羟甲基丙烷三丙烯酸酯（TRIM）粒子反应嫁接形成聚合物。表面印迹法解决了模板分子包埋过深或过紧而无法洗脱下来的难题。

3 分子印迹技术在黑木耳功效成分分离中的应用

3.1 黑木耳中生物碱类功效成分的分离

生物碱是指存在于自然界的一种含氮的碱性化合物，具有抗肿瘤、抗癌的特性。黑木耳中含有一些生物碱，具有促进消化道、泌尿道腺体分泌的作用。目前，应用分子印迹技术提取生物碱类活性物质已成为研究热点。

李小燕等^[20]以川穹中提取出的活性生物碱川穹嗪为模板分子，丙烯酸为功能单体，改性松香为交联剂，采用水溶液聚合法合成具有松香骨架的盐酸川穹嗪MIPs；结果表明，该MIPs对模板分子盐酸川穹嗪具有良好的特征吸收和选择吸附特性。卢彦兵等^[21]以生物碱奎宁为模板分子，以α-甲基丙烯酸为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，合成MIPs，结果表明奎宁MIPs具有较高的吸附能力和选择识别能力，奎宁MIPs与奎宁分子的离解常数达1.08×10^-3mol/L，表观最大吸附量为131.8μmol/g，为理论值的56.4%。Dong等^[22]合成了以（–）-麻黄碱为模板分子的MIPs，将其用于分子印迹固相萃取，直接从麻黄中提取出了（–）-麻黄碱，经HPLC验证，其纯度和回收率都比较高。

可以利用从黑木耳中提取出的生物碱为模板分子，采用合适的功能单体和交联剂合成黑木耳生物碱MIPs，通过分子印迹固相萃取，直接从黑木耳中提取出功能性生物碱。

3.2 黑木耳中腺苷类功效成分的分离

黑木耳中含有一种水溶性成分，可以抑制血小板聚集的腺苷类物质，具有降低血脂和血粘度，减轻动脉硬化，防止血栓形成和中风发生等功能。徐云等^[23]以环腺苷酸为模板，三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁晴为引发剂，按照一定比例超声混合，引发聚合，获得MIPs，实验验证，其对模板具有选择吸附能力。Hattori等^[24]以肌腺苷为模板分子制成分子印迹复合膜，发现该膜对肌腺苷的传递速率是咖啡因的1.25倍。Piletsky等^[25]成功制备了对腺苷酸的分子印迹膜，获得腺苷酸MIPs。

3.3 黑木耳中麦角甾醇类功效成分的分离

甾醇是一类由3个己烷环及一个环戊烷稠合而成的环戊烷多氢菲衍生物，黑木耳中含有的甾醇为麦角甾醇，是产生维生素D₂的前体。甾醇分子大多含有一个刚性骨架和羟基取代基，因而可利用羟基和功能单体形成氢键或酯键制备相应的MIPs，使之得到高效的分离。张圣祖等^[26]用3-胆固醇酰氧基丙酸（COPA）为模板分子制得分子印迹聚合有机凝胶，该凝胶对胆固醇的吸附效率可达64%。Kugimiya等^[27]采用共价方法，利用p-2-乙烯基苯硼酸和油菜素甾醇中的两组顺式羟基法制酯化作用，制备了油菜素甾醇的分子印迹聚合物。韩永萍等^[28]采用悬浮聚合法合成豆甾醇MIPs，结果表明，经过优化得到的MIPs对豆甾醇有快速稳定的特异吸附能力，其分离因子超过1.65，吸附容量约为1.2mg/g。Wei等^[29]用沉淀聚合法合成17-β-雌二醇分子印迹聚合物，并用HPLC测定其吸附效率，结果表明，沉淀聚合法优于本体聚合法。

3.4 黑木耳中磷脂类功效成分的分离

磷脂是一类含有磷酸的脂类，是由磷酸相连的取代基因（含氨碱或醇类）构成的亲水头和由脂肪酸链构成的疏水尾组成的。磷脂对活化细胞，维持新陈代谢和增强免疫力都发挥着作用。黑木耳中含有丰富的磷脂，主要有卵磷脂、脑磷脂和鞘磷脂。任科^[30]采用分子印迹技术制备出能够特异性识别磷脂酰乙醇胺的MIPs，结果表明，MIPs吸附9h能够达到饱和吸附量，能够特异性吸附磷脂酰乙醇胺。

3.5 黑木耳中黄酮类功效成分的分离

   黄酮类化合物是指两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接而成的化合物，黄酮是一种很强的抗氧剂，防止衰老，并可以改善血液循环，降低心脑血管疾病的发生。张丕奇^[31]等从黑木耳中提取出了黄酮类化合物，总黄酮含量平均值可达4.83%。郑细鸣等^[32]用单步溶胀聚合法制备出单分散柚皮素MIPs微球，其对模板分子具有很强的吸附能力，分离因子达1.96。颜流水等^[33]通过分子印迹技术，利用热聚的方法，以槲皮素为模板分子，丙烯酰胺为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，合成了槲皮素MIPs，其对槲皮素有很高的的亲和性。Trotta等^[34]以二氢黄酮柚皮苷为模板分子，采用相转移法制备了丙烯晴-丙烯酸共聚物膜，该膜对柚皮苷的吸附量为0.13μmol/g。

3.6 黑木耳中多酚类功效成分的分离

多酚是指具有多个酚基团的化学物质，具有很强的抗氧化作用。黑木耳中含有多酚类化合物，但是目前对其研究很少。刁小琴等^[35]利用超声辅助提取黑木耳中的多酚，其得率为0.92%；陈钢等^[36]通过优化微波条件提取黑木耳中的多酚类化合物，提取率为0.72%。钟世安等^[37]以表没食子儿茶素没食子酸（EGCG）为模板分子，在光冷引发条件下合成EGCG的MIPs，结果表明，EGCG的回收率达到69.3%，使用多次后选择性识别能力仍未降低。

3.7 黑木耳中大分子功效成分的分离

黑木耳中含有较高的蛋白质，多肽和多糖，木耳黑色素等分子量较大的大分子物质，研究证明，黑木耳中这些大分子物质具有明显的生物活性，包括抗肿瘤，增强机体免疫力，降血脂、血压、血糖等功效。目前，生物大分子印迹聚合物的制备方法大致分为包埋法、表面印迹法和抗原决定基法。Hjerten等^[38,39]利用包埋法，以丙烯酰胺为单体合成低交联度的凝胶，对血红蛋白、肌红蛋白等进行分子印迹，其MIPs具有良好选择性。Kempe等^[40]以甲基丙烯酸和4-乙烯基吡啶为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯和三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂，通过低温光引发的方法分别制备了以不同的多肽为模板分子的印迹聚合物。

综上所述，黑木耳中含有多种功效成分，如何选择合适的功能单体，交联剂，和聚合方法，了解印迹过程和识别过程的机理，寻找温和有效的洗脱剂，以及得到均一颗粒的MIPs，都是从黑木耳中分离功效成分的关键点。

4.      结论及展望

作为高新技术的分子印迹技术具有很多优点和很高的发展潜力，虽然目前还有很多亟需解决的问题及技术的不完善，但是其高选择性及分离特异性的优点，将会解决黑木耳中功效成分分离效率低，容易丢失微量有效成分，分离手段繁琐等问题，因此，MIT在黑木耳及菌蕈活性成分的分离中具有良好的应用前景。

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