氢气吸入对局部晚期头颈部肿瘤同步放化疗患者血清代谢组的影响

简易摘要

既往研究针对接受同步放化疗（CCRT）的局部晚期头颈部肿瘤（LAHNC）患者开展氢气吸入相关探索，提示该手段或许能够减轻治疗相关不良反应。但是，同步放化疗期间辅助吸入氢气所对应的血清代谢组特征尚不明确。为此，本研究分析了同步放化疗联合辅助氢气吸入治疗的局部晚期头颈部肿瘤患者血清代谢组变化。研究结果发现，患者体内嘌呤代谢、脂质相关通路代谢物出现探索性改变，提示氢气吸入可能在一定程度上调节同步放化疗过程中机体针对治疗相关氧化应激产生的全身代谢应答。

摘要

背景：氢气吸入可选择性调控活性氧（ROS），有望减轻治疗诱发的氧化损伤。本研究旨在探讨局部晚期头颈部肿瘤患者接受同步放化疗期间，辅助吸入氢气对血清代谢组谱及临床不良反应的影响。方法：将 20 例患者前瞻性随机分为两组：A 组仅接受标准同步放化疗；B 组同步放化疗联合辅助氢气吸入。采集所有患者治疗前后血清样本，采用基于非靶向超高效液相色谱 - 离子淌度四极杆飞行时间高分辨质谱（UHPLC-IM-QTOF-HRMS）的代谢组学技术进行检测分析。结果：B 组 1 例受试者中途退出试验，最终共 19 例患者纳入统计分析。相比于单纯同步放化疗组，联合氢气吸入组中度治疗相关不良反应发生率数值更低、化疗延期情况更少、整体治疗时长更短。单纯同步放化疗组患者治疗后，精氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢相关代谢物出现探索性改变；鸟氨酸、尿酸、四氢脱氧皮质酮是同步放化疗后具备潜在区分效能的候选差异代谢物。与之相比，接受氢气辅助吸入的患者代谢通路变化范围更小；基于单一代谢物匹配通路的初步分析提示嘌呤代谢通路可能参与其中。尿酸水平波动叠加多种脂质相关代谢物变化，共同反映同步放化疗过程中机体针对治疗相关氧化应激产生的代谢应答。组内前后差值（Δ= 治疗后−治疗前）的组间直接对比显示：氢气辅助吸入组血清尿酸下降幅度数值更小，但差异未达到统计学显著性。结论：局部晚期头颈部肿瘤患者同步放化疗期间辅助吸入氢气，可能与中度治疗相关不良反应减少、全身代谢组谱发生探索性改变相关。但本研究未设计评估肿瘤治疗结局；受样本量有限、患者异质性、缺乏独立外部验证等因素制约，代谢组相关结果（尤其是通路层面解读）仅为探索性结论，多条通路仅依靠单一或少数匹配代谢物推导得出。后续需要纳入更大规模独立队列，开展全面组间代谢组分析，进一步验证本研究结论。

关键词：代谢组学；局部晚期头颈部肿瘤；同步放化疗；氢气；氧化应激；嘌呤代谢；尿酸

1 引言

同步放化疗（CCRT）仍是局部晚期头颈部肿瘤（LAHNC）的标准根治方案，相较于单纯放疗（RT），可实现更好的肿瘤控制效果并改善患者生存。尽管具备上述临床获益，同步放化疗常引发显著急性与慢性不良反应，包括口腔黏膜炎、吞咽困难、口干、听力损伤。这些不良事件会严重降低患者生活质量，部分情况下还会影响治疗依从性，导致治疗无法顺利完成。调强放疗（IMRT）等放疗技术进步虽然降低了部分并发症发生率，但远期不良反应依旧具备显著临床影响。一项纳入 21 项随机对照试验的汇总分析显示，采用现代放疗技术开展同步放化疗的局部晚期头颈部肿瘤患者中，17% 出现≥3 级远期咽炎，16% 出现≥3 级吞咽困难，38% 发生≥2 级口干 [1]。

放疗诱发组织损伤的核心机制为活性氧（ROS）生成，尤其是羟基自由基（・OH），进而引发正常组织氧化应激与细胞损伤。科研人员探索了多种策略减轻放疗相关氧化损伤，包括使用自由基清除剂 [2]。各类活性氧中，羟基自由基反应活性强、具备细胞毒性，电离辐射通过其造成组织损伤的机制，已在体外与体内模型中得到充分证实 [3]。虽然多种传统抗氧化剂在临床前研究中展现出放射防护作用 [2]，但如何选择性保护正常组织、同时不削弱肿瘤控制效果，仍是一大难题。

近年来，分子氢（H₂）作为一种潜在选择性抗氧化物质受到关注。研究认为氢气优先与高活性氧化剂（特别是羟基自由基）发生反应，同时对参与细胞信号传导、具备生理功能的活性氧影响极小 [3,4,5]。临床前研究证实，氢气能够减轻放疗诱发的 DNA 损伤，提升照射后细胞活力 [4,5]。临床试验进一步表明，健康成年人长期吸入氢气具备安全性与良好耐受性，为其临床应用提供支撑 [6]。尽管上述结果令人鼓舞，但现有证据提示氢气很难作为通用放射防护剂，其生物学作用机制尚未完全阐明 [3,4,5,6,7,8,9]。因此，仍需开展更多机制与临床研究，明确氢气在同步放化疗中的作用，证实其临床疗效。

基于上述研究背景，多项临床试验探究了氢气吸入在肿瘤患者中的安全性与潜在治疗价值。一项纳入 16 例接受调强放疗患者的回顾性研究显示，每日吸入 5% 氢气 30 分钟可显著缓解放疗所致骨髓抑制；相比于对照组，受试者白细胞、血小板计数更高，且抗肿瘤疗效未见明显受损 [7]。另一项纳入 82 例肿瘤患者的队列研究显示，连续 3 个月每日吸入氢气不少于 3 小时，可改善患者乏力、失眠与疼痛症状 [8]。依托上述研究，本团队前期开展的初步研究证实：局部晚期头颈部肿瘤患者在全部 33 次同步放化疗期间每日吸入氢气具备可行性与安全性，无氢气相关不良事件，但该研究未探究治疗引发的代谢改变 [9]。

代谢组学是一套强大的系统生物学研究手段，可用于解析疾病机制、治疗应答规律以及筛选生物标志物 [10]。通过检测体液内小分子代谢物，代谢组学能够揭示治疗诱发的细胞与全身生化改变。本研究旨在明确接受同步放化疗（联合 / 不联合氢气辅助吸入）的局部晚期头颈部肿瘤患者血清代谢组变化。据我们所知，本研究是首批探索局部晚期头颈部肿瘤患者同步放化疗期间辅助氢气吸入相关血清代谢组改变的研究之一。我们提出假设：同步放化疗期间辅助吸入氢气，会使氧化应激及全身代谢应答相关代谢物产生探索性变化。解析这类代谢改变，有助于理解治疗相关生物学应答，为后续研发耐受性更佳、个体化的局部晚期头颈部肿瘤治疗策略提供机制研究与临床试验假说。为补充非靶向代谢组分析结果，本研究针对目标代谢物，对比各组受试者治疗前后代谢指标的变化差值（Δ= 治疗后−治疗前），进一步探索氢气吸入潜在生物学效应。

2 材料与方法

2.1 伦理审批

本前瞻性随机干预临床试验旨在探究局部晚期头颈部肿瘤患者同步放化疗期间，辅助氢气吸入对血清代谢组的影响。研究已在泰国临床试验注册中心（TCTR）完成注册，注册号：TCTR20240515006（注册日期：2024 年 5 月 15 日）。研究方案经泰国清迈大学医学院人体研究伦理委员会批准（批准日期：2024 年 1 月 30 日；研究编号：RAD-2566-0615；课题 ID：615）。试验严格遵循《赫尔辛基宣言》开展，所有受试者入组前均签署书面知情同意书。

2.2 研究对象

入组标准：签署知情同意书；年龄 18\70 岁；东部肿瘤协作组体能状态（ECOG）0\2 分；组织学确诊局部晚期头颈部肿瘤，适合接受根治性同步放化疗。排除标准：远处转移；区域复发；既往头颈部放疗史；无法耐受放疗、化疗或氢气吸入；气管造口状态。受试者招募时间：2024 年 3 月 —2025 年 1 月（图 1）。

图 1 受试者招募、分组、随访及分析 CONSORT 流程图共 20 例患者随机分组：单纯同步放化疗组（A 组，n=10）、同步放化疗联合氢气吸入组（B 组，n=10）。氢气吸入组 1 例受试者终止干预。评估指标包括治疗依从性、同步放化疗急性不良反应、代谢组图谱。

2.3 氢气吸入方案

采用单盲（评估者设盲）、区组随机化方案，将符合标准受试者随机分为对照组（A 组，单纯标准同步放化疗）与试验组（B 组，同步放化疗联合每日氢气吸入）。B 组患者使用鼻导管每日吸入氢气 1 小时，每次放疗前 1~2 小时实施。氢气由氢气发生器（Hycellvator ET 100；日本 Helix 公司，东京）产生，气体流速 1.67 L/min。两组采用一致的同步放化疗方案：依据肾功能选择每周顺铂（40 mg/m²）或卡铂（曲线下面积 AUC=2），联合调强放疗，总分割次数 30\33 次，疗程 6\6.5 周 [9]。依据通用不良事件术语标准 5.0 版（CTCAE 5.0）每周评估同步放化疗相关不良反应 [11]。不良反应评估医师对分组情况设盲，记录每位患者全程治疗中出现的最严重不良事件。受试者基线资料汇总见表 1。

表 1 受试者基线资料与治疗信息

2.4 样本制备

采血前患者禁食 10~12 小时，最大限度减少饮食干扰。所有局部晚期头颈部肿瘤患者分别在同步放化疗开始前、全部治疗结束后，使用血清分离管采集外周静脉血。室温下 3000 rpm 离心 10 min，分离血清转移至 1.5 mL 微量离心管，−80 ℃保存待测。

代谢组检测前，血清样本冰上解冻；取 150 μL 血清，加入 450 μL 70% 甲醇溶液（内含 55 mg/L 4 - 氯 - L - 苯丙氨酸作为内标，美国 Sigma-Aldrich 公司）。涡旋混匀 30 s，4 ℃条件下 13000×g 离心 10 min。上清液转移至洁净 1.5 mL 离心管，经亲水聚四氟乙烯（PTFE）滤膜（孔径 0.22 μm）过滤后，采用超高效液相色谱 - 离子淌度四极杆飞行时间高分辨质谱（UHPLC-IM-QTOF-HRMS；安捷伦 6560，美国安捷伦科技公司）进行分析。

2.5 代谢组学检测

采用安捷伦 InfinityLab 超高效液相色谱系统联用安捷伦 6560 IM-QTOF 质谱系统开展非靶向代谢组检测（美国安捷伦公司）。色谱分离使用安捷伦 Poroshell 120 HILIC-Z 色谱柱（2.7 μm，2.1 × 100 mm）并配套保护柱；柱温 30 ℃，流速 0.3 mL/min。流动相 A 相：含 0.1% 甲酸（体积分数）、10 mM 甲酸铵水溶液；流动相 B 相：水 / 乙腈（1:9，体积比），含 0.1% 甲酸、10 mM 甲酸铵。进样体积 4 μL。梯度洗脱程序：0–10 min，B 相比例 100% 降至 70%；10–10.5 min，维持 70% B 相；10.5–12 min 恢复至 100% B 相；随后 100% B 平衡至 14 min，总运行时长 14 min。

质谱检测采用电喷雾电离（ESI）正离子模式；全扫描质荷比范围 m/z 100–1700，同步自动采集二级质谱（Auto MS/MS）。每份样本连续进样 3 次技术重复，评估检测重复性。在检测序列中周期性注入混合质控样本（所有研究样本等量混合配制），监测仪器稳定性与检测质量。离子源参数：干燥气温度 225 ℃，干燥气流速 13 L/min，雾化压力 60 psi；鞘气温度 340 ℃，鞘气流速 12 L/min；毛细管电压 3000 V [12]。本研究仅采用正离子模式采集数据，偏好负离子电离的代谢物可能检出不足。因此本分析仅覆盖部分代谢组；后续研究需要同时采用正负离子模式，实现更全面的代谢物检测。

2.6 数据处理与统计学分析

原始液质数据使用 Progenesis QI 软件（2.3 版；英国 Nonlinear Dynamics 公司）处理，处理后数据导出开展后续统计分析。单纯同步放化疗组治疗前后样本初始检出代谢特征峰 1169 个；同步放化疗联合氢气吸入组初始检出 1162 个。经过预处理与质量筛选后，分别保留 385 个、389 个代谢特征峰用于统计分析。

代谢物注释依据精确母离子质荷比、二级碎片谱图，比对人类代谢组数据库（HMDB）、METLIN 二级质谱数据库、诗里拉吉代谢组数据库（SiMD）完成 [13,14,15]。匹配标准：母离子质量偏差＜5 ppm，碎片离子质量偏差＜5 ppm。按照代谢组学标准倡议（MSI）指南判定注释置信度。由于未使用标准品比对，所有代谢物鉴定结果均为推定注释。本次分析未采用碰撞横截面积（CCS）信息辅助注释。开展通路富集与生物学解读前，剔除外源性物质、药物相关代谢物、饮食来源化合物以及无法识别的代谢特征峰，提升结果生物学相关性与可解读性。

处理后数据集采用 MetaboAnalyst 6.0 分析。连续变量根据情况以均值 ± 标准差或中位数表示；采用 Shapiro–Wilk 检验判断数据正态性。组内对比采用配对 t 检验，组间对比采用独立样本 t 检验；不满足正态分布时，分别采用威尔科克森符号秩检验、曼 - 惠特尼 U 检验。由于本研究属于初步探索性试验、样本量有限，临床结局仅作描述性汇总；连续临床指标采用曼 - 惠特尼 U 检验对比。双侧 p＜0.05 定义为差异具有统计学意义。

采用主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS–DA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS–DA）开展多变量分析，探索各组治疗前后代谢改变。上述分析旨在挖掘治疗相关代谢模式，不用于构建预测模型或直接推导组间疗效差异。采用拟合优度 R²、预测能力 Q² 评价模型效能；通过置换检验（n=2000）进一步验证 OPLS–DA 模型稳健性。受样本量偏小、代谢组数据高维特性影响，谨慎解读多变量结果，降低模型过拟合风险。

差异代谢物筛选标准：投影变量重要性（VIP）≥1.0，倍数变化（FC）≥1.2 或≤0.83，经本雅明–霍赫贝格校正后错误发现率（FDR）校正 p＜0.05。在 MetaboAnalyst 6.0 中开展受试者工作特征（ROC）曲线分析、计算曲线下面积（AUC），评估候选代谢物区分治疗相关代谢改变、氢气吸入干预特征的效能。文中报告的 ROC 曲线下面积均基于同一筛选数据集，属于样本内探索性估计，未开展外部验证或交叉验证；AUC≥0.7 视作具备可接受的初步区分效能。依托京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库开展通路富集、代谢集富集分析 [16,17,18,19]。

尿酸是本研究重点目标代谢物，为进一步评估组间治疗相关变化差异，计算每位受试者尿酸指标的组内差值（Δ= 治疗后−治疗前）。这项靶向分析用于补充非靶向代谢组结果，直接对比两组治疗引发的代谢变化；组间 Δ 值对比采用曼 - 惠特尼 U 检验。

3 结果

3.1 受试者基线资料

如图 1 所示，共 31 例患者纳入入组筛选，最终 20 例随机分为两组：单纯同步放化疗组（A 组，n=10）、同步放化疗联合氢气吸入组（B 组，n=10）。B 组 1 例受试者在放疗第 14 次时撤回知情同意，放弃全部治疗，选择中草药替代疗法。最终 A 组 10 例、B 组 9 例纳入治疗依从性、急性不良反应、血清代谢组分析。基线资料如表 1 所示：A 组与初始 B 组（n=10）年龄（中位数 55.5 岁 vs 59 岁，p=0.54）、性别分布（p=0.61）、原发肿瘤部位（p=0.67）、肿瘤分期（p=0.47）、化疗方案（p=0.26）均无统计学差异。两组基线人口学与临床资料大体均衡；但样本量偏小，难以检出微小基线差异。

3.2 治疗依从性与总治疗时长

共计 19 例患者纳入评估（A 组单纯同步放化疗 n=10；B 组同步放化疗 + 氢气吸入 n=9）。A 组化疗延期更多：10 例中有 6 例出现化疗延迟，B 组 9 例中有 3 例发生延期，差异无统计学意义。B 组整体治疗时长略短，中位数 48.0 天（区间 48–49 天）；A 组中位数 51.5 天（区间 48–56 天）（表 2）。该描述性结果提示，辅助氢气吸入组治疗连续性可能更好；但样本量有限、差异无统计学意义，无法得出确定性结论。

表 2 治疗依从性与急性不良反应汇总

3.2.1 急性非血液学不良反应

两组均出现轻中度放射性皮炎。A 组：6 例 1 级皮炎、4 例 2 级皮炎；B 组：7 例 1 级皮炎、2 例 2 级皮炎；两组均无 3 级皮炎。咽炎以低级别为主：A 组 7 例 1 级、3 例 2 级；B 组 8 例 1 级、1 例 2 级，无 3 级咽炎。黏膜炎严重程度组间存在数值差异：A 组 5 例 1 级、4 例 2 级、1 例 3 级黏膜炎；B 组 4 例 1 级、5 例 2 级黏膜炎，未观察到 3 级黏膜炎。总体来看，两组同步放化疗急性非血液学不良反应以 1\2 级为主；氢气吸入组 2\3 级不良事件发生率数值更低，但组间差异无统计学意义（表 2）。

3.2.2 急性血液学不良反应

白细胞减少情况组间略有区别：A 组 3 例 0 级、1 例 1 级、4 例 2 级、2 例 3 级；B 组 4 例 0 级、3 例 1 级、2 例 2 级，无 3 级病例，差异无统计学意义。中性粒细胞减少整体程度轻微：A 组 3 例 0 级、4 例 1 级、2 例 2 级、1 例 3 级；B 组 4 例 0 级、4 例 1 级、1 例 2 级，无 3 级病例。血小板减少发生率较低：A 组 8 例 0 级、2 例 1 级，无 2 级；B 组 8 例 0 级、1 例 2 级，无 1 级。两组血液学不良反应大多为 0~2 级，治疗期间仅少数 3 级事件，组间对比无统计学差异（表 2）。

截至末次随访（2026 年 2 月）：A 组 7 例、B 组 8 例无病灶证据；A 组 2 例、B 组 1 例出现区域复发；两组均未见远处转移。随访期间 A 组出现 1 例肿瘤相关死亡。受样本量与随访时长限制，本研究不用于评估肿瘤预后；上述临床结局仅作描述性报告，不能作为两组复发、生存、肿瘤控制等肿瘤学结局存在差异的证据。

3.3 血清代谢组图谱特征

为进一步解析治疗相关代谢改变，探索氢气吸入带来的潜在生物学应答，本研究开展血清代谢组检测。A、B 组局部晚期头颈部肿瘤患者血清采集方案见补充图 S1（治疗前后、有无氢气干预）。基峰色谱图对比可见：两组治疗前后样本均存在图谱差异，提示同步放化疗诱发代谢改变；对比单纯放化疗组，同步放化疗联合氢气组质谱图谱模式同样存在区别，提示两组治疗相关代谢模式可能存在差异。但上述观察仅为描述性结果，不能直接证明氢气特异性代谢效应。

3.4 多变量数据分析

采用 PCA、PLS–DA、OPLS–DA 对比 A、B 组局部晚期头颈部肿瘤患者同步放化疗前后血清代谢特征。A 组（单纯同步放化疗）：数据预处理与质控筛选后保留 385 个代谢特征峰用于分析。OPLS–DA 模型可以明显区分治疗前、治疗后样本（R²Y=0.988，Q²=0.948）；PCA 与 PLS–DA 聚类区分效果较弱（图 2a–d）。置换检验（n=2000）支持分组区分具备统计学可靠性；但受样本量偏小、代谢组高维特征影响，解读需谨慎（p＜0.0005）。

B 组（同步放化疗 + 氢气吸入）：预处理后保留 389 个代谢特征峰。OPLS–DA 模型同样可区分治疗前后样本（R²Y=0.991，Q²=0.918）；PCA、PLS–DA 分离趋势相对不显著（图 2e–h）。置换检验（n=2000）证实模型稳定；但样本有限，不能完全排除模型轻度过拟合（p＜0.0005）。综上，两组 OPLS–DA 模型均显示治疗前后样本存在分离，为后续差异代谢物、通路富集分析提供初步支撑，尚不构成治疗效应的确证证据。

图 2 多变量统计分析(a)(b)(c) 单纯同步放化疗组（A 组）患者治疗前后血清样本 PCA、PLS–DA、OPLS–DA 得分图；(d) 置换检验（n=2000）验证 A 组 OPLS–DA 模型稳健性。(e)(f)(g) 同步放化疗联合氢气吸入组（B 组）患者治疗前后血清样本 PCA、PLS–DA、OPLS–DA 得分图；(h) 置换检验（n=2000）验证 B 组 OPLS–DA 模型稳健性。

3.5 局部晚期头颈部肿瘤患者单纯同步放化疗后的差异代谢物与代谢通路变化

依托 OPLS–DA 模型开展差异代谢物分析，筛选同步放化疗前后血清样本中的治疗相关代谢改变。液质数据预处理质控后保留 385 个代谢特征峰；其中 54 个显著上调、34 个显著下调、212 个变化无统计学意义，85 个无法识别或未注释（图 3a）。按照严格筛选标准（VIP＞1.0，FC≥1.2 或≤0.83，FDR 校正 p＜0.05）共得到 63 个差异代谢特征峰：36 个在治疗前样本丰度更高，27 个治疗后升高（补充表 S1）。区分能力排名前 15 的血清代谢特征峰见图 3b，包括鞘磷脂、胞苷二磷酸二酰甘油、磷脂酰 - N - 甲基乙醇胺、神经酰胺、甘油三酯、N - 癸酰甘氨酸、尿酸、四氢脱氧皮质酮、鸟氨酸、(2S,3R)-2 - 氨基 - 3-[(2S)- 氨基 - 3 - 羟基丙酰] 氧基丁酸。多个鞘磷脂、甘油三酯等脂质代谢物以及氨基酸相关代谢物 VIP 分值较高，说明这类代谢物质在治疗相关代谢重塑中起到重要作用。生物学解读前剔除外源性物质、未识别代谢物以及生物学功能尚不明确的代谢特征。

图 3 同步放化疗前后血清代谢组改变(a) 火山图：同步放化疗前后样本显著差异代谢物。红点显著上调，蓝点显著下调，黑点无统计学差异。(b) OPLS–DA 筛选出区分能力前 15 位代谢物 VIP 分值。(c) 差异代谢物 KEGG 通路匹配：仅为单一代谢物映射通路，提供生物学参考，不代表通路确证性扰动。(d)(e)(f) 代表性差异代谢物箱线图：鸟氨酸、尿酸、四氢脱氧皮质酮治疗前后对比；纵坐标为归一化峰面积，图上方标注 FDR 校正 p 值。

开展 ROC 分析评估代谢物区分同步放化疗前后样本的效能。共有 30 个代谢特征峰具备初步区分能力（AUC≥0.7），AUC 区间 0.70~0.92（95% 置信区间 0.57–0.98），以鞘脂、甘油磷脂、中性脂质等脂质代谢物为主，同时包含氨基酸与氮代谢相关代谢物（表 3）。KEGG 通路分析得到一系列单一代谢物匹配通路，提示精氨酸生物合成、D - 氨基酸代谢可能参与（p＜0.05）；谷胱甘肽代谢、精氨酸与脯氨酸代谢、嘌呤代谢、类固醇激素生物合成同样依靠单个或少数代谢物映射得到（图 3c，表 4）。

表 3 局部晚期头颈部肿瘤患者同步放化疗前后血清差异代谢物表 4 同步放化疗前后差异代谢物 KEGG 通路映射（单一代谢物匹配通路）

值得关注：鸟氨酸是唯一匹配多条 KEGG 通路的代谢物，包括精氨酸生物合成、D - 氨基酸代谢、谷胱甘肽代谢、精氨酸脯氨酸代谢，提示上述通路可能发生变化，但不能证明通路整体扰动。鸟氨酸治疗后水平显著升高（FDR 校正 p=5.8×10⁻⁴，AUC=0.78，特异度 81%，灵敏度 83%）（图 3d，表 3）。与之相反，尿酸治疗后显著下降（FDR 校正 p=1.7×10⁻⁵，AUC=0.87，特异度 81%，灵敏度 87%），该变化可能与嘌呤代谢、氧化应激应答相关（图 3e，表 3）。四氢脱氧皮质酮在同步放化疗后同样显著降低（FDR 校正 p=5.4×10⁻⁵，AUC=0.79，特异度 77%，灵敏度 77%），可能关联类固醇激素代谢（图 3f，表 3）。通路富集结果需谨慎解读，多数富集通路仅由单个或少数代谢物支撑。

3.6 局部晚期头颈部肿瘤患者同步放化疗联合氢气吸入后的差异代谢物与代谢通路变化

依托上述 OPLS–DA 模型，进一步筛选同步放化疗联合氢气吸入患者治疗前后血清差异代谢物。液质数据预处理质控后保留 389 个代谢特征峰用于差异分析。其中 303 个完成注释纳入火山图分析：31 个显著升高、49 个显著降低、223 个变化无统计学意义；86 个代谢特征峰无法充分注释，剔除出生物学解读（图 4a）。按照预设筛选标准（VIP＞1.0，FC≥1.2 或≤0.83，FDR 校正 p＜0.05）筛选得到 43 个差异代谢特征峰：30 个治疗前丰度更高，13 个治疗后丰度上升（补充表 S2）。VIP 排名前 15 候选代谢物见图 4b。剔除外源性物质、未识别代谢物减少无关干扰后，剩余差异代谢物以脂质、氨基酸代谢物为主，包括鞘磷脂、甘油三酯、磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、脯氨酰天冬酰胺、丁酰肉碱、高精氨酸、尿酸。鞘磷脂、甘油三酯、磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱多项脂质代谢物 VIP 分值较高，提示同步放化疗后脂质相关代谢应答可能发生改变。

图 4 同步放化疗联合氢气吸入治疗前后血清代谢组改变(a) 火山图：联合氢气吸入治疗前后样本差异代谢物；红点上调、蓝点下调、黑点无统计学差异。(b) OPLS–DA 筛选前 15 位差异代谢物 VIP 分值。(c) KEGG 通路映射：依托差异代谢物尿酸得到单一代谢物匹配通路，仅用于生物学参考，不能证实通路整体扰动。(d) 尿酸归一化峰面积箱线图：联合氢气吸入治疗后尿酸水平显著下降（FDR 校正 p=4.5×10⁻³），提示嘌呤代谢改变，可能关联治疗相关氧化代谢应答。

开展 ROC 分析评估代谢物区分同步放化疗 + 氢气吸入治疗前后样本的效能（表 5）。共 18 个代谢特征峰具备初步区分能力，样本内 AUC 区间 0.70~0.88（95% 置信区间 0.58–0.95）。差异代谢物主要关联脂质代谢、氨基酸代谢，多个代谢物既往研究证实参与氧化应激应答。KEGG 通路映射依靠单一差异代谢物尿酸提示嘌呤代谢通路可能参与（图 4c）；尿酸治疗后水平显著下降（p=0.04）（图 4d，表 5）。尿酸是嘌呤分解代谢主要终产物，上述结果提示同步放化疗联合氢气吸入后，嘌呤代谢与氧化应激相关代谢应答发生改变。

尿酸在两组中均为最突出的治疗相关代谢物，因此后续直接对比两组尿酸的治疗前后变化差值，进一步评估氢气吸入的作用（3.7 部分）。需要注意：该通路映射仅基于单一代谢物，仅提供生物学线索，不能证明通路整体扰动；同时本研究未开展全面直接组间代谢组对比。

表 5 局部晚期头颈部肿瘤患者同步放化疗联合氢气吸入前后血清差异代谢物

3.7 两组受试者血清尿酸治疗前后变化差值的直接对比

尿酸在两组均被筛选为核心差异代谢物，也是嘌呤代谢初步富集的关键代谢物。本研究计算每位受试者血清尿酸治疗前后差值（Δ= 治疗后−治疗前），开展组间对比，探究两组治疗引发的尿酸变化是否存在区别。氢气吸入组尿酸下降幅度数值上小于单纯同步放化疗组，但组间差异未达到统计学显著性（p=0.11；表 6）。该结果提示：辅助氢气吸入可能使血清尿酸下降幅度更小，但不足以证实氢气特异性调控嘌呤代谢，结论仅具备探索性。虽然该现象与氢气组中度不良反应发生率数值更低相吻合，但无法推导因果关系，仍需要更大样本、检验效能充足的研究验证。

表 6 单纯同步放化疗组与同步放化疗联合氢气吸入组，受试者血清尿酸组内变化差值（Δ= 治疗后−治疗前）直接对比

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