富氢水对中国樱桃采后褐腐病的防控效果及其分子机制研究

1 引言

中国樱桃（Prunus pseudocerasus Lindl.）属于蔷薇科樱属，原产于我国西南地区，在中国已有数千年栽培历史。该树种开花、结果均较早，果实色泽鲜亮，果肉细嫩多汁、营养价值丰富（Wang 等，2022）。但褐腐病会造成樱桃果实腐烂、僵果（Palmieri 等，2022），同时还会引发落花、枝条枯死、树势衰退等问题（Yin 等，2015）。褐腐病可侵染李、波罗蜜、桃等多种果树，造成严重经济损失（Zhang 等，2017；Taylaran 等，2021；Xu 等，2021）。侵染中国樱桃的褐腐病致病菌主要为链核盘菌属（Monilinia spp.）真菌。该病不仅会缩短樱桃贮藏期，还具备潜伏性强、易传播的特点，幼果至成熟果均易染病，最终丧失商品价值（Mustafa 等，2021）。

目前褐腐病防控主要依靠化学杀菌剂与低温贮藏。但化学药剂易产生农药残留、诱导病原菌耐药；低温贮藏易造成果实机械损伤，且贮藏成本较高（Wu 等，2023；Gong 等，2022；Xing 等，2018）。因此，研发安全有效的采后防控技术，对降低中国樱桃采后损耗、延长货架期、提升商品果率、保障产业收益具有重要现实意义。

富氢水（HRW）可提升植物各类胁迫耐受能力，改善作物品质与产量，延长果蔬货架期（Ma 等，2021）。已有研究表明，富氢水能缓解草莓渗透胁迫、提升抗氧化酶活性，并通过调控内源激素缓解草莓幼苗盐胁迫带来的生长抑制（Wang 等，2024a）；富氢水可通过维持胞内氧化还原稳态减轻黄瓜幼苗盐胁迫损伤（Yu 等，2023）；氢气可通过调控激素信号通路改变水稻胁迫抗性（Zeng 等，2013）；富氢水处理能显著提高小麦种子叶绿素与可溶性蛋白含量，降低细胞凋亡，同时增强小麦根、苗抗氧化酶活性（Islam 等，2023）。此外，大量研究证实富氢水可延长生鲜果蔬货架期、改善采后品质（Li 等，2021a），秋葵采后富氢处理可有效延缓衰老，贮藏期果实品质保持效果更佳（Dong 等，2023）。

现阶段，针对富氢水防控核果类（尤其中国樱桃）采后褐腐病的研究十分匮乏，现有报道多聚焦秋葵、草莓等其他果蔬的保鲜效果，富氢水在樱桃 - 病原菌互作体系中的调控机制尚不清晰。因此开展富氢水在中国樱桃上的应用研究，具备重要生产实践价值。

转录组与代谢组联合分析可从分子、细胞层面系统解析植物抗病防御机制（Li 等，2021b）。利用多组学联合分析侵染青枯病的茄子植株发现，病原菌会显著上调茉莉酸（JA）含量及茉莉酸信号通路相关基因（Xiao 等，2023）；花椒侵染花椒炭疽菌的组学联合研究证明，苯丙烷代谢介导花椒抗病，黄酮、茉莉酸甲酯通路是核心抗病途径（Han 等，2023）；葡萄白粉病多组研究阐明了病害侵染过程中的分子、激素与代谢调控机制，并筛选出没食子酸、二十烷酸作为病害早期代谢标志物（Pimentel 等，2021）。综上，多组学整合分析是解析植物抗病分子机制的重要手段。

本研究采用转录组、代谢组联合分析，从基因表达、代谢物积累层面解析富氢水诱导中国樱桃采后免疫应答与抗病生化基础。旨在阐明富氢水调控樱桃抗褐腐病的分子机制，为开发绿色采后保鲜技术提供理论依据，同时丰富氢气信号介导果实抗病相关分子机理研究。

2 材料与方法

2.1 试验材料

试验果实：中国樱桃品种‘黑珍珠’，采自贵州省贵阳市乌当区樱桃种植基地。果实运回实验室后散去田间余热，挑选大小、成熟度均匀，无机械损伤、无病虫的果实备用。试验菌株：桃褐腐菌（Monilinia fructicola），分离自表现典型褐腐病症状的‘黑珍珠’中国樱桃果实。

2.2 试验方法

2.2.1 富氢水制备

常温下将纯度 99.99%（体积分数）高纯氢气以 300 mL・min⁻1 流速通入 3 L 蒸馏水，持续通气 3 h 制备饱和富氢水（北京活力氢源饮品有限公司）。采用便携式富氢检测仪（日本 Trustlex ENH-100）测得饱和富氢水氢浓度为 0.8 mmol・L⁻1。将饱和富氢水稀释配制成 0%（蒸馏水对照）、25%、50%、75%、100% 浓度梯度备用（Hu 等，2014）。

2.2.2 果实处理

将樱桃果实置于不同浓度富氢水中浸泡 20 min（Zhang 等，2019），自然晾干后接种褐腐病菌，分别处理 0、12、24、36、48、60 h。处理结束后迅速液氮速冻，置于 - 80 ℃超低温冰箱保存备用。每组 30 颗果实，设置 3 次生物学重复。

2.2.3 病原菌接种

孢子悬浮液配制与接种流程：将桃褐腐菌接种至马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，25 ℃恒温培养箱避光培养 7 d；无菌条件下用无菌水冲洗培养基表面孢子，过滤得到高浓度孢子悬液；血球计数板计数，配制浓度为 1×10⁴ CFU・mL⁻1 的孢子悬浮液。樱桃果皮使用 75% 乙醇消毒，无菌接种针在果实赤道位置扎 3 mm 深伤口，每颗伤口滴加 10 μL 孢子悬浮液，置于 25 ℃恒温培养箱培养（Zhang 等，2023a）。

2.2.4 病斑直径、病情指数、失重率测定

设置 0% 富氢水（对照组 CK）、25%、50%、100% 富氢水处理组，每 12 h 观测发病情况并测量病斑直径（Chen 等，2024）；从出现病斑开始，每 12 h 统计病情指数。病情指数计算公式：病情指数 (DI) = [Σ(各级发病果数 × 该级病级值) / (总果数 × 最高病级值 ×5)] × 100%式中 X 代表 0~5 级病级，Nx 为对应病级果实数量（Zhu 等，2021）。每 24 h 称量果实单果重量，计算果实失重率（Wang 等，2025）。

2.2.5 抗病相关酶活性测定

选取 0% 富氢水（CK）、25% 富氢水处理组果实，分别在病原菌接种后 0、12、24、36、48、60 h 取样，测定各类防御酶活性。称取 0.1 g 果肉，加入 1 mL 对应酶提取液，液氮充分研磨成匀浆，转移至离心管，按对应酶体系离心获得粗酶液。采用北京盒子生物试剂盒分别测定过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、几丁质酶（CHI）、β-1,3 - 葡聚糖酶（GLU）活性，测定单位为 U・g⁻1（Tian 等，2024）。每组 3 次生物学重复，试验独立重复 3 次。

2.2.6 代谢组检测与数据分析

选取 CK、25% 富氢水处理、接种 36 h 的樱桃果肉开展非靶向代谢组分析（百迈客云平台 BMKCloud www.biocloud.net，Zhang 等，2024）。取约 50 mg 冷冻果肉，加入 1 mL 含内标（20 mg・L⁻1）提取液（甲醇：乙腈：水 = 2:2:1，体积比），涡旋 30 s；冰浴超声研磨 10 min，-20 ℃静置 1 h；4 ℃、12000 rpm 离心 15 min；取上清真空快速干燥，加入 160 μL 复溶液（乙腈：水 = 1:1，体积比）涡旋、低温超声、再次离心，上清上机检测。检测仪器：沃特世超高效液相色谱串联高分辨质谱（UPLC Acquity I-Class PLUS 搭配 Xevo G2-XS QTOF）。数据分析：基于 METLIN、公共数据库、百迈客自建库完成多变量统计，包括主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），评估组内与质控样本重复性；鉴定代谢物后匹配 KEGG、HMDB 数据库获取分类与通路信息。筛选差异代谢标准：差异倍数 FC≥1.5、P<0.05、变量重要性投影 VIP≥1，采用超几何检验分析差异代谢物 KEGG 通路富集显著性。

2.2.7 转录组测序与数据分析

选取 CK、25% 富氢水处理果肉，依托百迈客云平台完成转录组测序（Zhang 等，2024）。使用天根植物总 RNA 提取试剂盒提取样品总 RNA；Nanodrop 2000 分光光度计测定 RNA 浓度与纯度，安捷伦 2100 生物分析仪检测 RNA 完整性；采用翌圣双模式 mRNA 文库试剂盒构建测序文库，Illumina NovaSeq 6000 平台上机测序。原始测序数据过滤得到干净读段（Clean Reads），利用 HISAT2 软件比对甜樱桃参考基因组（Prunus_avium.PAV_r1.0.genome.fa）；采用 FPKM 值（每百万比对片段中，每千碱基转录本的片段数）量化基因表达量；DESeq2 筛选差异表达基因（DEG），筛选阈值 FC≥1.5、P<0.05；对差异基因开展 GO 功能富集、KEGG 通路富集分析。

2.2.8 转录组 - 代谢组联合分析

基于百迈客云平台整合两组学数据，将全部差异基因、差异代谢物同步映射至 KEGG 通路，获得共富集通路信息（Li 等，2024）；根据差异基因富集通路，筛选各组中基因、代谢物共同显著富集的前 30 条通路；使用 R 语言 ggplot2 包绘制 KEGG 富集柱状图。

2.2.9 实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）验证

选取樱桃 Actin 作为内参基因，挑选 12 条关键差异基因开展 qRT-PCR，验证转录组测序可靠性。使用 Primer 5.0 设计荧光定量引物（附表 S1）；Takara 反转录试剂盒将 RNA 反转录为 cDNA；TB Green 定量试剂盒扩增，每个样本设置 3 个技术重复，采用 2⁻ΔΔCt 法计算基因相对表达量。

2.3 数据处理

使用 Excel 2019 整理原始数据；IBM SPSS 25.0 开展单因素方差分析、独立样本 t 检验、主成分分析；Origin 2022 绘制全部试验图表。

3 结果

3.1 富氢水处理对樱桃病斑直径、病情指数、失重率的影响

对照组（CK）接种 24 h 后出现病斑，各富氢水处理组发病时间推迟至 36 h，富氢处理可将发病时间延后 12 h（图 1a）。所有富氢处理组病斑直径均显著低于对照组，其中 25% 富氢水抑制效果最优（图 1b）；富氢处理可显著降低病情指数，25% 浓度防控效果最佳（图 1c）；富氢组果实失重率显著低于对照组，25% 处理组失重波动最小，与 CK 差异显著（图 1d）。

图 1 富氢水处理对桃褐腐菌接种后中国樱桃病斑扩展 (a)、病斑直径 (b)、病情指数 (c)、失重率 (d) 的影响注：不同小写字母代表组间差异显著（P<0.05），下文统一适用。

综上，25% 富氢水对病斑扩展、病情指数上升、果实失重增加的抑制作用最强，因此选取 25% 富氢水处理样本开展后续多组学深度分析。

3.2 25% 富氢水处理对樱桃抗病相关酶活性的影响

过氧化物酶（POD）：富氢组全程酶活高于对照组；CK 组峰值出现在 24 h，富氢组峰值在 48 h（图 2a）。多酚氧化酶（PPO）：整体呈升 - 降 - 升趋势；除 0 h 外，各时间点富氢组 PPO 活性均显著高于 CK；CK 峰值 60 h，富氢组峰值 12 h（图 2b）。苯丙氨酸解氨酶（PAL）：先升后降；CK 峰值 12 h，富氢组峰值 24 h（图 2c）。几丁质酶（CHI）：变化趋势为先升、再降、后上升；CK 与富氢组均在 60 h 达到活性最大值（图 2d）。β-1,3 - 葡聚糖酶（GLU）：接种后先升高后降低，两组峰值均出现在 12 h（图 2e）。

总体来看，采后富氢处理可不同程度提升 POD、PPO、PAL、CHI、GLU 活性，增强樱桃果实抗病能力。

图 2 富氢水处理对褐腐菌侵染樱桃 POD (a)、PPO (b)、PAL (c)、CHI (d)、GLU (e) 活性的影响

3.3 樱桃代谢组测序及质控分析

对 CK、25% 富氢处理接种 36 h 的樱桃开展非靶向代谢组主成分分析，第一、第二主成分分别解释 31.83%、17.68% 总变异，各组生物学重复离散程度低，重复性良好（图 3a）；OPLS-DA 结果与 PCA 一致，两组间存在明显差异代谢物（图 3b）。

图 3 樱桃果实代谢组 PCA 分析 (a)、OPLS-DA 分析 (b)

3.4 差异代谢物分析

基于 OPLS-DA 模型，以 VIP≥1、P<0.05、FC≥1.5 为筛选标准，共鉴定出 223 个差异代谢物，其中上调 66 个、下调 157 个（图 4a）。223 个差异代谢物注释得到 58 条 KEGG 通路，分为代谢、遗传信息处理、环境信息处理三大类，绝大多数代谢物富集于代谢通路（图 4b）。排名前 20 的富集通路见图 4c，核心通路包括黄酮与黄酮醇生物合成、嘌呤代谢、丙氨酸 - 天冬氨酸 - 谷氨酸代谢、亚油酸代谢、花青素合成、异黄酮合成等。

图 4 差异代谢物统计 (a)、差异代谢物 KEGG 分类 (b)、KEGG 富集气泡图 (c)

3.5 樱桃转录组测序及质控

CK、25% 富氢两组共 6 个样本 Illumina 高通量测序，获得 42.02 Gb 干净数据，单样本数据量 6.027.96 Gb；Q20 碱基占比均高于 97.55%，Q30 高于 93.19%，GC 含量 45.60%45.81%（附表 S2）。HISAT2 比对甜樱桃参考基因组，总比对率 84.08%85.20%，唯一比对序列 79.68%80.91%，多重比对 4.29%~4.54%，测序数据质量满足后续分析要求。

3.6 差异表达基因分析

DESeq2 筛选（FC≥1.5、P<0.05）得到 340 个差异表达基因，相比 CK，富氢组上调 176 个、下调 164 个（图 5a）。GO 功能注释分为生物过程（16 类）、细胞组分（3 类）、分子功能（10 类）三大本体（图 5b）：生物过程富集代谢、细胞进程、生物调控；细胞组分富集细胞结构、胞内组分、蛋白复合物；分子功能富集催化、结合、转运活性。340 个差异基因注释到 70 条 KEGG 通路，分为代谢、遗传信息处理、环境信息处理、有机体系统、细胞过程五大类，前 20 条富集通路见图 5d，核心通路为光合天线蛋白、苯丙烷生物合成、黄酮生物合成、缬氨酸 / 亮氨酸 / 异亮氨酸降解、木质素 / 木栓质 / 蜡质合成等。

图 5 差异基因火山图 (a)、GO 富集分类 (b)、KEGG 注释分类 (c)、差异基因 KEGG 富集图 (d)

3.7 转录代谢联合分析：25% 富氢调控苯丙烷、黄酮合成通路

多组学联合 KEGG 富集共得到 22 条显著通路，其中黄酮生物合成（ko00941）、苯丙烷生物合成（ko00940）、角质 / 木栓质 / 蜡质合成（ko00073）富集程度最高（图 6a）。转录组结果显示苯丙烷、黄酮通路大量差异基因显著富集，两条通路是樱桃抵御桃褐腐菌的核心调控途径。

图 6 差异基因与代谢物联合 KEGG 富集 (a)、富氢调控苯丙烷 - 黄酮通路网络图 (b)注：红色代表上调基因 / 代谢物，绿色下调基因，蓝色下调代谢物

整合通路内差异基因、代谢物构建樱桃抗褐腐 “基因 - 代谢” 调控网络（图 6b）：

1. 苯丙烷通路：富氢上调 4CL、CCR、BGLU、C3’H、CAD 共 9 个结构基因，促进松柏苷积累，同时下调 4 - 羟基苯乙烯；2 个 POD 编码基因下调。

2. 黄酮通路：上调 CHS、CHI、C3’H、DFR 共 6 个关键基因，促进短叶松素 - 3 - 乙酸生成；山奈酚、柚皮素、二氢山奈酚含量降低。富氢协同调控苯丙烷木质素相关基因与黄酮合成关键基因，促进细胞壁相关代谢物、抗菌抗氧化类黄酮积累，显著提升樱桃抗褐腐能力。

3.8 qRT-PCR 验证

选取苯丙烷、黄酮通路 12 个核心差异基因开展荧光定量验证，qRT 表达变化趋势与转录组 FPKM 表达趋势完全一致，证明转录组测序结果可靠（图 7）。

图 7 转录组 FPKM 值 (a)、qRT-PCR 相对表达量 (b) 验证注：数据为平均值 ± 标准误；P<0.05，P<0.01，**P<0.001，ns 无显著差异

4 讨论

园艺产品采后腐烂由病原菌侵染、贮藏不适等多重胁迫造成，直接大幅缩短货架期（Posadinu 等，2023）。富氢水是氢气应用最便捷的形式，可提升园艺作物抗病性，诱导生物、非生物胁迫抗性（Wu 等，2019；Yu 等，2023；Yang 等，2024）。现有研究证实：60% 富氢水处理可显著抑制梨果腐烂（Dong 等，2022）；富氢水能减轻猕猴桃、切花月季木质部细菌堵塞与腐烂（Wang 等，2020；Fang 等，2021）；同时增强水稻对条纹病毒的抗性（Shao 等，2023），说明富氢水具备广谱抗病诱导作用。

本试验结果表明，所有浓度富氢水处理均可推迟褐腐病发病时间：对照组 24 h 出现病斑，富氢组推迟至 36 h；同时缩小病斑、降低病情指数与失重，25% 浓度效果最优。酶活测定结果显示富氢可提升 POD、PPO、PAL 活性，与猕猴桃相关研究结论一致（Liu 等，2023）；本研究中 CHI、GLU 在侵染后快速升高，与猕猴桃试验存在差异。整体机制上，富氢水并非直接杀菌，而是通过提升果实防御酶活性，诱导樱桃自身系统抗性。

转录组高通量技术广泛用于香蕉、芒果、葡萄等果蔬抗病机理研究（Zhu 等，2022；Jiang 等，2022；Li 等，2023b）。马齿苋盐胁迫富氢转录组显示，富氢上调差异基因大量富集植物激素信号、苯丙烷合成、植物 - 病原菌互作通路，显著调控抗氧化相关基因，缓解盐害（Zhang 等，2023b）。本研究共筛选 340 个樱桃差异基因（上调 176、下调 164），GO 注释分为 29 个功能类，KEGG 集中富集光合天线蛋白、苯丙烷、黄酮、支链氨基酸降解通路。

代谢组可系统解析植物内外源代谢物变化，广泛应用各类作物抗病研究（Li 等，2023a；Anwar 等，2024）。三叶青冷胁迫多组联合研究表明，富氢抑制冷诱导黄酮大量积累，减轻低温损伤（Liu 等，2022）。本试验共鉴定 223 个差异代谢物，涵盖脂类、苯丙烷、核苷酸等，KEGG 富集黄酮、嘌呤、花青素、二萜合成通路，证明黄酮代谢调控是植物应对生物、非生物胁迫的通用机制，仅响应模式随物种、胁迫类型存在差异。

苯丙烷通路合成的黄酮、酚类物质具备强抗菌活性（Qian 等，2023；Wang 等，2023）。葡萄白粉病代谢组发现感染果实大量富集酚酸、黄酮、萜类、木脂素等抗病代谢物，核心防御通路为苯丙烷 - 黄酮代谢（Yu 等，2022）；黄瓜白粉病、多毛番茄抗病多组研究同样证实黄酮、苯丙烷通路是核心抗性通路（Zhang 等，2021；Wang 等，2024b）。本研究转录代谢联合 KEGG 共富集 22 条通路，苯丙烷、黄酮通路富集最显著，证明两条通路是樱桃抵御桃褐腐菌的关键分子通路。

为阐明富氢调控樱桃抗褐腐完整分子网络，本研究整合两条通路全部差异基因与代谢物分析：富氢上调 4CL、CCR、BGLU、C3’H、CAD 等苯丙烷关键基因，促进下游松柏苷积累；同时诱导 CHS、CHI、C3’H、DFR 黄酮结构基因上调，提升短叶松素 - 3 - 乙酸含量。由此证实：富氢水通过协同激活苯丙烷、黄酮生物合成通路，提高中国樱桃对褐腐病的系统抗性。

5 结论

富氢水处理可显著缩小桃褐腐菌侵染后中国樱桃病斑直径，降低病情指数与果实失重率，并不同程度提升 POD、PPO、PAL、CHI、GLU 五种防御酶活性。转录组筛选得到 340 个差异表达基因，主要富集光合天线蛋白、苯丙烷生物合成、黄酮生物合成、植物激素信号转导通路；代谢组鉴定 223 个差异代谢物，集中富集黄酮与黄酮醇合成、嘌呤代谢、丙氨酸 - 天冬氨酸 - 谷氨酸代谢、亚油酸代谢通路。转录组与代谢组联合分析显示苯丙烷、黄酮合成通路显著富集；通路内 4CL、CCR、BGLU、C3’H、CAD（苯丙烷通路）、CHS、CHI、DFR（黄酮通路）基因显著上调，松柏苷、短叶松素 - 3 - 乙酸对应代谢物同步积累。富氢水通过协同激活苯丙烷、黄酮生物合成通路内基因与代谢物，提升中国樱桃果实对褐腐病的综合抗性。

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