氢气对人类脂肪组织的直接效应研究

从这个研究结果看，氢气能控制脂肪组织的生长，主要是因为降低了氧化应激水平。提示氢气对脂肪组织健康有潜在价值。本研究的亮点是对人类组织进行直接效应观察，结果比较可靠客观。缺点是这种效应使用的氢气剂量非常高，除了局部给氢气外，人类通过吸入和饮用氢水都很难达到如此高浓度。

本研究论文作者来自日本，最近发表在Sci Rep上。

脂肪组织中的氧化应激可能会改变脂联素的分泌模式，并可能促进动脉粥样硬化。然而，氢气在氧化应激下的脂肪组织中的治疗作用仍不清楚。在本研究中，从12名接受开放心脏手术且通过胸骨正中切口的患者收集了皮下脂肪组织（SCAT）。然后将脂肪组织浸泡在含有通过产氢装置生成的氢气的培养基中。在氢化前后测量脂肪组织的重量，并对组织进行核因子红系相关因子2（Nrf2）、血红素氧合酶-1（HO-1）和超氧化物歧化酶（SOD）的免疫染色，这些是氧化应激的标志物。免疫染色结果显示，氢化组中HO-1和Nrf2表达水平显著降低，而SOD表达水平增加，但没有达到统计学意义。脂肪组织的图像分析显示脂肪细胞大小减小。此外，氢化后的脂肪组织显示出脂联素基因表达水平有增加趋势，而涉及脂肪生成的脂联素chemerin的基因表达水平有减少趋势。这些结果证明了氢气对氧化应激的脂肪组织和减小脂肪细胞大小的治疗潜力。

图 氢气对人类组织组织的体外效应研究。

介绍

分子氢（H2）是一种无色无味的气体，也是最轻和最丰富的化学元素。氢气是一种弱还原剂，其氧化还原反应仅在存在强氧化剂导致组织损伤时才会发生。由于其低分子量，氢可以轻易穿透细胞膜到达线粒体（ROS产生的地方）或储存遗传信息的细胞核，从而保护这些细胞器免受氧化损伤。近年来的研究集中在氢减轻氧化应激的能力上，突显了其潜在的预防和治疗益处。氢被认为是一种有效的抗氧化剂，能够减少氧化应激。在心血管外科手术中，氢的主要功能是减少缺血作用，可能预防动脉粥样硬化。还注意到，在饮用高浓度富氢水的小鼠中，与动脉粥样硬化病变相关的血管内皮细胞老化受到抑制。然而，关于其精确机制仍有许多问题未解，特别是它在脂肪组织中的作用。

脂肪组织是受活性氧种（ROS）失衡影响最严重的之一。在脂肪组织中，高营养摄入导致ROS生成。脂肪组织中的氧化应激已被涉及改变脂联素分泌轮廓，可能加剧如动脉粥样硬化等疾病状况，这是一种以炎症细胞浸润和大动脉中因过量ROS导致的脂质积累为特征的常见心血管疾病。此外，通过关注脂肪组织中的氧化应激，可以预防和治疗血管功能障碍。肥胖中增加的ROS生成与脂肪组织中脂联素表达失调密切相关，脂肪组织是一个主要的内分泌器官，包含各种细胞成分，包括合成和分泌一系列称为脂联素的生物活性分子的脂肪细胞。这些分子在调节全身代谢和炎症中提供关键功能。

脂联素是另一种在肥胖和糖尿病患者中水平较低的脂联素。脂联素调节底物代谢和血管壁健康，与HDL-胆固醇和高分子量脂联素水平呈正相关，而总血清和高分子量脂联素水平与甘油三酯和炎症标记物水平呈负相关。

Chemerin也被鉴定为由脂肪组织分泌的一种脂联素。它是树突状细胞和巨噬细胞的趋化因子，促进成脂分化，并在体内和培养的内皮细胞中显示出促血管生成潜力。Chemerin和趋化因子样受体1（CMKLR1）在脂肪组织中高度表达，主要在成熟脂肪细胞中。血浆chemerin水平在肥胖、冠状动脉疾病和2型糖尿病的患者和动物中增加，并与胰岛素抵抗相关。

几种酶，如SOD和HO-1，可以减少ROS水平并作为抗氧化防御。脂肪细胞特异性过表达HO-1减少了高脂饮食诱导的肥胖和血管功能障碍，同时通过调节脂联素水平和炎症增强了胰岛素敏感性和脂肪细胞功能。SOD催化超氧化物自由基转变为较少有害的物质，而HO-1通过分解血红素产生抗氧化和抗炎化合物。这些细胞保护过程对于维持细胞稳态至关重要，特别是在细胞应激下。

Nrf2也是一种转录因子，在抗氧化系统调节中发挥关键作用。在正常条件下，Nrf2与细胞质中的Kelch样ECH关联蛋白1（Keap1）结合。在氧化应激反应中，Nrf2转移到细胞核，在那里它与抗氧化应答元件结合。Nrf2增强包括抗氧化酶SOD和HO-1在内的几种细胞保护基因的表达。Nrf2在脂肪组织中高度表达，但其在脂肪细胞生物学中的具体功能尚不清楚。

研究结果

研究结果来自12名接受开胸手术并经中线胸骨切开术途径获取皮下脂肪组织的患者的数据分析。这些患者中，男性占比58%，女性占比42%，平均年龄为71.3±7.9岁，平均体质指数（BMI）为23.8±1.8 kg/m²。高血压、血脂异常、超重和糖尿病的患病率分别为33%、8%、42%和42%。

表 1 患者特征。

在氢气浓度的测量方面，为确保培养基中充分溶解氢气，使用了来自日本东京Miz公司的溶解氢浓度测量试剂进行测定。通过滴定法将6毫升试剂加入培养基中，观察培养基从黄色变为深蓝色所需的滴数来计算溶解氢浓度，平均为2-3 PPM。氢化前，氢气浓度为2.58 PPM。氢化24小时后，使用氢气发生器调整至2.5 PPM，并在48小时后保持较高水平，平均为3.13 PPM。氢化48小时后，与之前的两次测量相比，培养液中的氢气浓度显著增加。

图1氢气浓度测定

在脂肪组织重量的测量方面，所有患者组织均分为两部分，分别置于氢化培养基和对照培养基中，并在48小时后检查形态学变化。结果显示，氢化组中脂肪组织在培养液中的溶解度高于对照组。氢化组的脂肪组织重量显著低于对照组。同时评估了脂肪组织重量减少的速率，对照组略有减少，而氢暴露组减少速率明显增加。氢化后，脂肪组织平均减重率从13.7%增加到20.1%。由于培养基含水量高，干重差异可能更为显著。此外，在氢化组的培养液整个表面观察到脂肪滴（箭头所示），而在对照组中未观察到。

总体而言，这项研究初步探讨了氢气对脂肪组织的影响，结果表明氢气可能对脂肪组织具有一定的调节作用。然而，需要更深入的研究来验证这些发现，并进一步了解氢气对脂肪组织的具体作用机制。同时，研究也提醒我们，在面对健康问题时，应保持科学的态度，寻求专业医生的建议和指导。.

图 2 氢气对脂肪组织外观和质量的影响。

(a) 48小时氢化后脂肪组织外观的变化。 (b) 线图显示了48小时氢化后脂肪组织重量的变化。结果以平均值±标准误差（SE）表示。*p < 0.05与对照组相比。(c) 培养液的外观。

为了评估氢气是否在显微水平上引起脂肪组织和脂肪细胞的形态变化，使用ImageJ软件（美国国家卫生研究院，马里兰州贝塞斯达）测定了脂肪组织和脂肪细胞的大小（图3a）。氢化后，脂肪组织大小减少了78.9%（图3b），氢化组的脂肪细胞大小比对照组减少了83%（图3c）。

图3 氢气对脂肪组织的影响（HE染色）

(a) 苏木精和伊红染色的脂肪组织。标尺，200微米。(b) 氢化后脂肪组织尺寸减少。(c) 氢化后脂肪细胞尺寸减少。图中的数据使用Image J进行量化。结果以平均值±标准误差（SE）表示。**p < 0.01与对照组相比。

氢化对Nrf2、HO-1和SOD表达的影响

通过检查代表性氧化应激标志物Nrf2、HO-1和SOD的变化，研究了氢化对氧化应激的影响，使用免疫荧光染色进行分析。免疫染色显示，氢化组中Nrf2和HO-1的表达水平显著降低，同时伴随着脂肪细胞大小的减小。相反，尽管SOD的表达水平有所增加，但没有观察到显著差异。使用ImageJ软件量化每个细胞和区域的脂肪组织的荧光强度（图4a、c、e）。图4a和c描绘了48小时氢化后Nrf2和HO-1表达水平的差异，表明氢化组的水平低于对照组。在氢化组中，细胞计数和细胞面积比例均显著较低（图4b、d）。这些图表显示了12名患者Nrf2和HO-1表达水平的百分比变化，将氢化组的相对表达与对照组设为1。氢化后，Nrf2的表达水平每个细胞的强度降低了38%，每单位面积的强度降低了48%（图4b）。HO-1的表达分别降低了23%（每个细胞的强度）和46%（每单位面积的强度）（图4d）。该图表展示了12名患者SOD表达的百分比变化，将氢化组的相对表达与对照组设为1。氢化后，我们观察到SOD表达水平增加了20%（每个细胞的强度）和12.6%（每单位面积的强度）。SOD水平因患者而异，有些病例显示增加，有些则显示减少。总体而言，在平均百分比增加中没有观察到显著趋势（图4f）。

图4 氢气对脂肪组织的影响（免疫组织化学）

免疫组织化学染色用于确定脂肪组织中Nrf2、HO-1和SOD的表达水平。(a, c, e) 红色表示用Alexa Fluor 594染色的Nrf2（a）、HO-1（c）和SOD（e），蓝色表示用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色的细胞核，绿色表示用Alexa Fluor 488-鬼笔环肽染色的周围组织。从绿色区域提取仅包含脂肪细胞的区域，并使用Image J量化脂肪组织每个细胞数量和面积的荧光强度，测量沿红色部分内黄色线的读数。这些图表显示了12名患者Nrf2、HO-1和SOD表达水平的百分比变化，将氢化组的相对表达与对照组设为1。结果以平均值±标准误差（SE）表示。* p < 0.05，** p < 0.01与对照组相比。标尺，500微米。

为了研究氢气对脂肪细胞中脂联素基因的影响，我们在氢化后三小时使用定量聚合酶链反应（qPCR）测量了脂联素的表达。观察到chemerin表达减少了42%（图5a），相应的CMKLR1表达水平也减少了26.7%（图5b）。相反，脂联素的表达增加了13%，尽管差异不显著（图5c）。

图5  氢化后3小时脂联素的定量PCR结果。(a) Chemerin (b) CMKLR1和(c) 脂联素的表达结果以平均值±标准误差（SE）表示。** p < 0.01, * p < 0.05与对照组相比。

讨论

本研究首次利用心脏手术中获取的体外脂肪组织样本，探讨氧化应激标记物和脂肪细胞大小的改变。我们旨在阐明氢化对这些参数的影响及其在脂肪组织生理学中的治疗作用。需要指出的是，这些脂肪组织样本是在全身麻醉下通过手术获得的，这与通常的体内条件不同。我们使用的SCAT是在患者同意的情况下从胸骨下方区域获得的。在心脏手术中，SCAT比心外膜脂肪组织（EAT）、心包脂肪组织（PCAT）和主动脉周围脂肪组织（PAAT）更容易获得。实验发现显示，氢化后Nrf2和HO-1的表达水平显著降低，脂肪细胞大小减小。在氢气给药实验的准备过程中，直接暴露术中脂肪组织样本揭示了新发现。这些发现为理解氢气对脂肪组织的影响提供了潜在见解，并揭示了其在减少脂肪积累和改变脂肪细胞代谢中的治疗作用。

多项研究表明，Nrf2和HO-1的表达可以缓解氧化应激。体外添加氢气导致Nrf2和HO-1表达水平显著下降的发现表明，氢气直接降低了ROS水平或减少了Nrf2和HO-1的表达水平。或者，氢气可能广泛缓解了氧化应激。然而，氢气的作用效果以及这些氧化应激标记物表达减少的机制在本实验中无法直接证明。氢气对氧化应激的详细机制及其临床意义是未来研究的课题。

一些研究表明，Nrf2缺乏会降低目标抗氧化基因的表达。即使在没有Nrf2的情况下，氢气也可以减少ROS引起的氧化损伤。此外，Nrf2敲除小鼠显示出明显的脂肪组织质量和脂肪细胞大小减少。富含氢气的盐水单一疗法降低了HO-1的表达水平。由于压力条件显著增强HO-1的表达和活性，HO-1在抗氧化和抗炎反应中的主要作用被暗示。相比之下，虽然在某些情况下添加氢气抑制了SOD的表达，但在其他情况下没有观察到显著减少或趋势。很难确定影响氢气对SOD表达抑制作用的临床标准。一些研究表明，氢气处理增加了SOD的活性。冠心病患者在疾病早期阶段表现出更高的SOD表达。然而，随着疾病的进展，SOD表达被下调。在高压力条件下，SOD可能在独立于Nrf2表达水平的情况下永久表达。在氢化组中，即使观察到Nrf2和HO-1表达水平下降后，SOD表达仍然保持。顺便说一句，通过氢气暴露，Nrf-2和HO-1的mRNA表达有减少的趋势；但没有观察到显著差异（补充图）。这些结果之间的差异可能是由于翻译后长非编码RNA的作用或氢气通过泛素-蛋白酶体系统抑制蛋白质降解；后者的实验尚不确定。

尽管氢气添加可能对某些途径有主要影响，但其在所有氧化应激途径中的参与仍不清楚。在氢化后，我们观察到脂肪细胞大小的显著减少。然而，氢气减少脂肪细胞大小的机制尚不明确。人们认为脂肪细胞膜中脂质双层的形态改变会导致细胞内的脂肪分解；然而，这一过程目前尚不确定。虽然在用塑料容器密封生产氢气时会在气相中产生一些压力，但考虑到脂肪组织处于液相中，压力的影响被认为是微小的。氢气可能通过改变脂质双层的行为来物理性地减小脂肪细胞的大小。脂肪细胞大小的减少可能不仅仅是由于Nrf2表达水平的降低，还涉及其他因素。需要进一步研究以阐明这一现象背后的精确机制及其临床意义。氢气可以通过两种方法获得：直接购买充装在钢瓶中的氢气，或如本实验所示，使用氢气发生设备将氢气溶解在溶剂中。这种氢气发生设备的优势在于能够产生溶解氢气的液体，最高观测值为3 PPM。由于产生的氢气量适中，引发爆炸的风险极低，因此使用安全。尽管氢气几乎完全用于治疗目的，但由于其抗氧化特性，近年来其临床应用逐渐增加。在心血管手术领域，正在进行使用氢气保护器官免受损伤和提高存活率的临床试验。高浓度（1.2–1.6 PPM）的饮用水对小鼠具有神经保护作用。富氢水（氢气浓度：1.9 PPM）被用作补充剂，帮助运动员提高表现并减轻疲劳。此外，我们没有研究抑制Nrf2和HO-1表达如何影响PCAT和PAAT，这两者都被认为会受到动脉粥样硬化的影响。在未来，我们将检查EAT、PCAT和PAAT中的脂肪因子表达水平，这些水平可能会因氢化而显著改变。脂肪细胞缩小在美容医学中的临床影响是有益的，并且本研究使用了活体生物体来证明在直接暴露于氢气下脂肪组织会发生收缩。然而，由于氢气浓度高且暴露时间长（48小时），这个实验仅限于离体研究，因此与实际临床应用有所不同。这一氧化应激不仅发生在脂肪细胞中，也发生在邻近的成纤维细胞中，表明氢气可能在心脏手术之外有多种临床应用。使用qPCR，我们分析了几种可能参与动脉粥样硬化的细胞因子的基因表达水平，并观察到chemerin呈下降趋势，脂联素呈上升趋势。然而，由于不同患者表现出不同的变化，只有chemerin显示出显著差异。白细胞介素1β和肿瘤坏死因子-α的水平没有显著差异（数据未显示）。脂联素仅由脂肪组织分泌，其在SCAT中的表达水平高于内脏脂肪组织。脂联素水平的增加会减少脂肪细胞大小并增加脂肪细胞数量。这些结果表明，脂肪因子的氢化可能导致脂肪因子表达的变化；然而，尚不清楚这些变化是否显著。Chemerin和CMKLR1与脂肪生成有关，而不仅仅是作为脂肪因子的功能。因此，当氢气诱导脂肪收缩时，会导致脂肪生成能力的减弱，而不仅仅是减少有害细胞因子的存在。它还与炎症和氧化应激有关。另一项研究表明，富氢/盐水处理（HRS）显著降低了肢体缺血/再灌注后的chemerin表达水平。HRS可以改善肺损伤并降低chemerin水平，其保护作用与chemerin水平的增加密切相关。顺便说一句，技术问题阻止了我们通过Western blot或ELISA准确评估脂肪因子的蛋白水平。图6提出了氢气对脂肪组织直接作用的拟议方案。本研究中调查的组分与氢气对离体脂肪组织的直接作用相关的现象有关，应为未来的氢气研究提供重要信息。

这段研究的限制在于：

‣我们无法得出关于氢化与其他因素（如性别和年龄）之间相关性的结论。此外，这些发现是基于少量案例得出的。

‣我们无法找到基于这项调查结果所研究的所有这些构念之间的关联。证明这些关联和机制是未来研究的主题。需要进一步的研究来解决这些问题。

总之，我们的发现表明，氢气减轻了脂肪组织中的氧化应激反应并减小了脂肪细胞的大小。这些结果突出了氢气在脂肪组织生物学和与氧化应激相关状况的临床应用中的潜在可能性。

方法

受试者

本研究的方案已获得名古屋市立大学医院伦理委员会的批准。我们招募了12名21岁及以上的受试者，包括7名男性和5名女性。通过胸骨正中切口开放心脏手术的方式，从患者身上收集皮下脂肪组织，并将该脂肪组织浸泡在含有产氢装置的培养基中，在37°C下孵育48小时。受试者在手术前需进行完整的血常规检查。在受试者参加研究前，已获得所有参与者的书面知情同意。所有方法均按照相关指南和规定执行。

临床参数

肥胖根据日本肥胖症学会的标准，定义为BMI>25 kg/m²。糖尿病根据日本糖尿病学会的指南定义。高血压定义为收缩压≥140 mmHg和舒张压≥90 mmHg。

氢气溶液的制备和浓度测定

在实验前一天，将500 mL的Dulbecco’s modified Eagle’s medium（低糖）补充有L-谷氨酰胺和酚红（FUJIFILM Wako，东京，日本）加入到25 mL的5%胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）中。在第一天进行氢化的当天，将约350 mL的培养液倒入两个聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）瓶（苏打水瓶）中。将水浴加热至37°C。

为氢气组准备PET瓶

将含有产氢剂的非织造布（Miz Corporation, Ltd.）填充到丙烯酸树脂管中。将管子插入充满培养液的PET瓶中，并用带有单向阀的盖子紧密封闭。氢气通过连接到丙烯酸树脂管的单向阀释放到水中。根据制造商的指示，它可以产生高达六个大气压；然而，实际测量显示，由于从PET瓶盖上的泄漏，它几乎相当于大气压。

溶解氢气浓度的测定

使用Miz Corporation的溶解氢气浓度测量试剂，随时间测定氢气浓度。在引入脂肪组织之前、24小时后和48小时后进行了三次氢气浓度测量。将6 mL的氢化溶液收集在杯子中。每次滴加20滴氢化浓度测定试剂，并混合溶液。溶液在滴定过程早期含有比亚甲蓝（MB）更多的氢气（将MB胶体铂（Pt）试剂倒入富含氢气的水中）。结果，MB被转化为 leuco-MB，溶液变为无色。在滴定终点时，溶液含有比氢气更多的MB，呈现蓝色。它含有由产氢装置（Miz Corporation）产生的氢气（约3 PPM）。