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你知道吗？我们有一种超级酷炫的方法，可以制造出大量的水气泡，而且啊，其中90%的气泡都小于1 μm那么小哦！（你看，图3就是它们的样子！）这时候呢，气泡的总密度简直惊为天人，达到了1.94 × 10^9个气泡/mL，你知道吗？这还不是最神奇的，这个密度在3个月后还是稳如泰山，一点都没变呢！

说到微气泡和氢气水，其实已经有很多研究和报告啦。但是之前的技术啊，都是靠混合气体和液体，然后用喷射器或者搅拌器来制造细气泡的，这样虽然能制造出气泡，但是啊，大小都不一样，有点杂乱无章的感觉。

不过呢，现在我们有了新招——共振起泡技术！这个技术能在共振装置里弄出一个减压的状态，然后让气泡在这个环境里共振起来，这样就能制造出大小差不多一样的细气泡啦！但是啊，这只是第一步，我们还得对这些气泡进行真空空化处理，让它们变得更大然后破裂，这样我们就能得到纳米级别的细气泡了，超级厉害吧！

这种方法造出来的超细气泡，大小超级均匀，而且没有浮力，可以长时间地在水里游来游去。简直就像是魔法一样！

纳米气泡是一种神奇的存在，过去一直不认为能长时间稳定存在，但现在已经明确这种气泡的稳定性让人惊叹，不过这种稳定性并不是绝对的。本研究结果发现，该团队自己制备的纳米氢气气泡能在PET材料容器内稳定保持100天，这显然对于氢气这种超级扩散能力的小分子气体来说，显得非常不可思议。因为这种长待机能力已经具备了商业化的条件。不过值得注意的是，本研究声称纳米气泡数高达到每毫升19亿个，这个数据比较多。本研究使用化学法测定抗氧化能力，不足以作为氢气量稳定性的硬证据，应该对水中容存的氢气量进行气相色谱分析。另外，既然能维持100天，应该观察更长时间。总之，这是相对孤立的证据，还需要更多验证性证据支持。

自由基，包括由氧化应激产生的活性氧物种，是生物紊乱的主要原因之一，并且已知与生活方式相关疾病的发生密切相关，例如衰老、动脉粥样硬化和糖尿病及其并发症。羟基自由基，活性氧物种中反应性最强和细胞毒性最大的一种，可以被氢选择性地还原。我们开发了一种通过使用直径小于1微米的超细气泡（UFBs）将氢气分散在水中来产生更稳定的氢气水的方法。本研究报道了抗氧化长寿命UFB氢气水的功能性特征。具有优异储存稳定性的UFB氢气水预计将有各种潜在的医疗应用，包括减少辐射损伤。

 Kamimura, C.; Ohba, R.; Yamaguchi, M.; Hosoda, M.; Kashiwakura, I. Functional Characteristics of Antioxidant Long-Life Ultra-Fine Bubble Hydrogen Water. Inorganics 2024, 12, 141. 

一.前言

氧气，对人类生命活动至关重要，因各种刺激而变成高度反应性的氧物种（ROS）。虽然ROS是一种细胞传递者和免疫功能，但过量产生会损害细胞和组织。由氧化应激产生的ROSs是生物紊乱的主要原因之一，并且已知与癌症、衰老、动脉粥样硬化和糖尿病及其并发症等生活方式相关疾病的发生密切相关。那些对抗ROSs和自由基起保护作用的统称为抗氧化剂[1,2]。另一方面，在发生意外且数量不详的辐射暴露事故时，减轻强烈辐射诱导的氧化应激的治疗策略变得极其重要，但目前还没有药物对策或治疗可以减少辐射损伤。

羟基自由基（•OH），ROSs中反应性最强和细胞毒性最大的一种，可以被氢分子（H2）选择性地还原。Yanagihara等人报告说，通过电解水产生的中性富氢水的摄入缓解了大鼠由化学氧化剂诱导的肝损伤[3]。同样，在大鼠心脏体内，分子氢的给药导致超氧化物歧化酶显著增加，分子氢缓解了辐射引起的脂质过氧化[4]。Ohsawa等人报告说，吸入氢气气体显著抑制了大脑损伤，通过缓冲氧化应激的影响。他们证明氢气选择性地还原了最具细胞毒性的ROSs中的羟基自由基，并有效地保护了细胞；然而，氢气不与其他具有生理作用的ROSs反应[5]。最近，Hirano等人也报告说，氢气易于应用，因为它没有副作用，并且对许多疾病有明显的疗效，包括与氧化应激相关的疾病和慢性炎症性疾病[6,7]。此外，几篇论文报告了氢气的放射防护效果。他们讨论了氢气的机制，不仅作为抗氧化剂，还包括抗炎症、抗凋亡和基因表达调节等细胞内反应，这展示了氢气作为一种新型且临床上可用的放射防护剂的前景[8]。然而，为了便于摄入氢气，最好是以氢气水的形式消费。尽管如此，关于氢气浓度、生产后的储存方法和长期稳定性仍然存在各种问题。

我们开发了一种通过使用直径小于1微米的超细气泡（UFBs）将氢气分散在水中来产生更稳定的氢气水的方法[9]。根据国际标准化组织（ISO）的术语，细气泡被定义为体积当量直径小于100微米的气泡[10,11]。此外，微气泡被定义为体积当量直径在等于或大于1微米到小于100微米范围内的细气泡，而UFBs是体积当量直径小于1微米的细气泡。

在本研究称UFB氢气水。本研究报道了抗氧化长寿命UFB氢气水的功能性特征。具有优异储存稳定性的UFB氢气水预计将在未来需要进一步的细气泡应用于学术和商业领域，如医学、动物学、植物学、生命科学、无机化学、电子学、原子物理学以及各种制造和清洁行业。

二.结果

2.1. UFB氢气水的氧化还原电位

使用磁力为0.8到1.0特斯拉的氢自由基水循环搅拌器，在纯水中以50 mL/min的流速加入氢气，生成UFB氢气水。此外，作为对照，创建了一个简单的UFB氢气水，没有添加磁化功能，准备了纯水，并使用Eh计测量了氧化还原电位（ORP）。去离子水的氧化还原电位处于+360 mV的氧化区域，而通过这种方法制备的UFB氢气水显示出-565 mV的强还原状态。作为比较制备的氢气水的值为-260 mV（表1）。

图1. 不同DPPH溶液浓度下UFB氢水的自由基清除率。

还原氢水中的溶解氢含量约为1.0 ppm–1.3 ppm，但在UFB氢水中，该含量增加到1.5 ppm–1.8 ppm。如果水系统中氢气的含量增加，溶解氧会被从水系统中排出。因此，还原氢水中的溶解氧含量减少到0.6 ppm或以下，而在UFB氢水中减少到0.06 ppm或以下。关于因还原处理引起的pH值变化，与自来水相比，还原氢水的pH值增加了0.4，而UFB氢水的pH值增加了0.6，因此两者都没有显示出显著的变化。这表明经过还原处理的水不会变成碱性，并且适合饮用。

2.2 UFB氢水对DPPH自由基的清除作用

DPPH（1,1-二苯基-2-苦基肼）是一种稳定的自由基，当存在自由基清除物质（花青素、番茄红素、胡萝卜素、氢自由基等）时，它们会发生反应并转变为非自由基。

本研究制备了最终DPPH浓度为1.96、3.85、5.67、9.09、75、100和150 μM的溶液，并确定了自由基清除能力（图1）。结果显示，在1.96 μM时观察到最高的自由基清除能力为6.5%，随着浓度的增加而降低。考虑到包括分光光度计在内的测量误差，接下来的实验使用9.09 μM的DPPH浓度进行。

2.3. UFB氢气水自由基清除能力的稳定性

含有DPPH的反应溶液在沸水中加热处理10至40分钟，并测定了自由基清除能力。结果表明，与未处理相比，加热10分钟使自由基清除能力降低了17%，20分钟时降低了44%，30分钟时降低了48%，40分钟时未检测到自由基清除能力，表明自由基清除能力随时间减少（表2）。

表2. 不同加热时间的平均DPPH自由基清除率。

另外，使用去离子水制备了pH 3和pH 4的柠檬酸水溶液，并使用上述方法生成UFB氢气水。制备了最终浓度为9.09 μM的DPPH自由基溶液，并测量了从pH 3和pH 4柠檬酸溶液或普通去离子水中生成的UFB氢气水的自由基清除能力。由于在pH 3和pH 4都获得了自由基清除能力，可以说自由基不易受pH影响。尽管pH 3和pH 4是广泛存在于食品和饮料中的酸性物质，但氢自由基气泡处理广泛用于赋予食品和饮料抗氧化功能，使其成为开发功能性食品的有前景的技术。 接下来，为了研究时间对UFB氢气水自由基清除能力的影响，调查了室温下存放在密封聚对苯二甲酸乙二醇酯容器中三个月的UFB氢气水的自由基清除能力。

结果显示，三个月后ORP和DPPH自由基清除率均未降低（图2），表明当UFB氢气水在密封条件下储存时具有长的抗氧化自由基寿命，并且能够稳定地保持其功能性三个月。

图2. UFB氢气水的稳定性。数据表示为三次独立实验的平均值±标准差。

三. 讨论

制造微气泡的方法包括以下几种：简单的喷射器方法、文丘里管方法、Shirasu多孔玻璃膜通过法、加压-减压法、超声波振动法、气液旋流两相法和空化法（包括在螺旋背面产生的空化）[12,13,14,15,16]。在上述方法中，加压-减压法、超声波振动法、气液旋流两相法和空化法可以生成UFBs。在这项研究中，我们报告了使用我们原创的共振起泡和真空空化生产系统制备的长期稳定UFB氢气水的特性。气泡的大小在制备中尤其成问题。大于10μm的气泡无法发挥其自由基功能，因为这样的气泡具有浮力，不能漂浮在水面上并在水中浮动；小于1μm的UFBs没有浮力，会在水中分散很长时间。本研究中使用的UFB氢气水的气泡平均粒径约为60nm（图3），这可能有助于其高功能性。由于其分子尺寸极小，氢气迅速穿透任何容器的玻璃或塑料壁，而铝壁可以相对较长时间保留氢气[17]。此外，在正常大气压下，H2气体可以稍微溶解于水中，最多达到0.8 mM（大约1.6 ppm，wt/vol），但它只能作为氢气水储存几天。通过这种方法制备的UFB水中的H2浓度没有显著差异，但即使在室温下存放在聚对苯二甲酸乙二醇酯容器中，也发现它在很长一段时间内是稳定的，并且其自由基清除能力保持了三个月。这一特性使得UFB氢气水可以在普通容器中稳定储存一段时间，这是极其创新的。预计它将在未来用于各种应用。

图3. UFBs大小分布与浓度之间的关系。循环水超过60分钟的典型测量值如下。总气泡平均粒径、主要部分平均粒径、粒径频率累积和的粒径、累积频率为总量的10%的粒径、累积频率为总量的50%的粒径、以及累积频率为总量的90%的粒径分别为68.6、49.2、37.8、36.9、58.3和112.6 nm。总气泡直径的平均值约为60 nm，主要部分粒子直径的平均值约为50 nm。

关于微气泡和纳米气泡的研究始于25至30年前。在2005年爱知世博会上，国立先进工业科学技术研究所的高山正芳先生展示了海水鱼和淡水鱼可以在同一个充满微气泡水的鱼缸中共生，这引起了全球对微气泡的兴趣。在由日本经济产业省赞助的2012财年微气泡和纳米气泡技术国际标准化促进活动报告中，基于气泡大小暂时定义了微气泡和纳米气泡，即大小为0.8 mm–1 mm或更大的空气泡称为气泡，大小为0.05 mm–0.1 mm或更大且小于“气泡”的空气泡称为亚毫米气泡，大小为20 μm–1 μm且小于“亚毫米气泡”的空气泡称为微气泡，大小为20 μm–1 μm或更小的空气泡称为超细气泡。此外，ISO将细气泡定义为体积当量直径小于100 μm的气泡，微气泡为体积当量直径1 μm或更大且小于100 μm的细气泡，UFBs为体积当量直径小于1 μm的细气泡[10,11]。通过这种方法获得的大多数（90%）水气泡大小小于1 μm（图3）。此时，总气泡密度为1.94 × 10^9个气泡/mL，并且在3个月后这个浓度仍然保持不变。迄今为止已经提交了许多有关微气泡和氢气水的报告和研究应用。在现有技术中，通过混合气体和液体并利用喷射器或搅拌器的空化作用剪切混合物来产生细气泡。使用剪切的方法不可避免地会产生各种大小的细气泡。尚未提出使用共振起泡技术来产生细气泡。为了使细气泡的大小均匀，可以在共振装置中产生减压状态并进行共振起泡，以实现几乎均匀大小的细气泡的产生。然而，简单地使用共振起泡技术会产生微米大小的细气泡，因此，在适当的减压状态下对生成的细气泡进行真空空化处理，可以扩大细气泡以使其破碎，从而使细气泡变为纳米大小的细气泡（<1μm）。这种方法可以形成几乎均匀大小的超细气泡。这种UFB没有浮力，因此它会长时间分散在水中。

加藤等人制备了纳米气泡氢溶解水（纳米氢气水），其中54%的总气泡含有直径小于717 nm的氢纳米气泡，并使用5,5-二甲基-1-吡咯啉N-氧化物（DMPO）-自旋捕获电子自旋共振法（ESR）和分光光度计2,2′-联吡啶方法评估了纳米氢气水的还原活性[18]。他们得出结论，与具有相似溶解氢水平的氢气水相比，纳米氢气水具有改善的抗氧化活性，这表明在清除羟基自由基方面，纳米气泡的重要性比氢气浓度更为显著。

由于分子氢通常不具有很强的反应性，它也选择性地减少最具细胞毒性的活性氧种类（ROSs）——羟基自由基，并有效保护细胞；然而，氢不会与其他具有生理作用的ROSs反应[5]。因此，氢作为潜在的抗氧化剂具有一些优势：它能有效中和活细胞中的羟基自由基，并且与大多数已知的抗氧化剂不同，这些抗氧化剂无法成功地针对细胞器[19]，它具有有利的分布特性：它能穿透生物膜并扩散到细胞质、线粒体和细胞核中。因此，氢可以作为一种有效的抗氧化疗法。电离辐射作用于细胞的组成部分——水，产生自由基和分子产物，如羟基自由基、氢自由基、水合电子和过氧化氢[20]。大约60-70%的DNA损伤是由自由基诱导的间接自由基作用引起的[21]。因此，作为选择性羟基自由基清除剂的氢气分子，具有作为放射防护剂的潜在医学应用。许多关于氢对辐射损伤减少效果的研究已被报道[22,23,24,25]。例如，赵等人评估了氢对小鼠免疫系统的放射保护效果，表明预先用氢处理可以增加脾脏指数并减轻辐射对脾结构造成的损伤，并且氢还抑制了脾细胞中的辐射诱导凋亡并下调了活体小鼠中的促凋亡蛋白[22]。他们建议，通过清除ROS，氢是免疫系统的有效放射防护剂。张等人检查了饮用富含氢的水是否能改善全身照射（TBI）小鼠的造血干细胞（HSC）损伤[23]。最后，他们证明富含氢的水缓解了TBI诱导的HSC损伤，涉及细胞数量变化以及对HSC的自我更新和分化。此外，刘等人指出，富含氢的水对辐射诱导的认知功能障碍具有保护作用，可能的机制主要涉及抗氧化和抗炎反应，以及通过调节脑源性神经营养因子及其受体、原肌球蛋白受体激酶B的信号通路来保护新生神经元[24]。平野等人检查了氢气治疗是否改善了癌症患者接受调强放射治疗（IMRT）诱导的骨髓损伤[25]。他们的结果表明，吸入氢气治疗缓解了IMRT诱导的骨髓损伤，而不影响IMRT的抗肿瘤效果，这表明吸入氢气治疗可能适用于癌症患者IMRT诱导的骨髓损伤。这些研究预计将为对抗辐射事故和核灾难引起的强烈氧化应激提供一种廉价且简单的方法。实际上，在我们的初步研究中，我们观察到UFB氢气水具有强烈的辐射缓解作用。

最近，肖等人测试了名为Hexa Z 氢气纳米气泡水的氢气泡水对过氧化氢（H2O2）或佛波酯（PMA；一种内源性超氧阴离子和过氧化氢的诱导剂）诱导的活性氧生成、脂质积累和白细胞介素-6（IL-6）分泌在OP9脂肪细胞和三维皮下脂肪等效物中的影响[26]。他们证明，Hexa Z 氢气纳米气泡水展现出卓越的稳定性，并能保护HaCaT细胞免受有害的H2O2诱导损伤。HW显著抑制了H2O2或PMA增强的OP9脂肪细胞和3D皮下脂肪组织中的脂肪生成、活性氧生成和IL-6分泌。因此，Hexa Z 氢气纳米气泡水可以作为预防代谢紊乱的潜在健康候选者。Hexa Z 氢气纳米气泡水显示出在细胞/组织水平上抑制氧化应激、炎症反应和脂肪生成的可能性。它可以用于防止肥胖人群发展代谢紊乱。此外，他们的研究小组报告了Hexa Z 氢气纳米气泡水浴对健康志愿者和炎症/胶原疾病患者血清中的氧自由基吸收基抗氧化能力和炎症指标C-反应蛋白（CRP）的影响。Hexa Z 氢气纳米气泡水浴设备在120分钟电解后提供了直径为110 ± 10 nm的纳米气泡和338–682 μg/L的溶解氢，并且随着相关溶解氢的增加，纳米气泡增加到9.91 × 10^7颗粒/mL。尽管在40°C下进行10分钟普通水浴的健康受试者的氧自由基吸收基抗氧化能力未改变，但进行10分钟Hexa Z 氢气纳米气泡水浴后120分钟将该能力提高到110.9 ± 9.2%。在Hexa Z 氢气纳米气泡水浴后120分钟，CRP水平被抑制到70.2 ± 12.1%，而普通水浴则有所增加。在结缔组织疾病患者中，经过9天至4个月的Hexa Z 氢气纳米气泡水浴后，CRP水平被抑制到3–24%。在其他六名患有多种自身免疫相关疾病的患者中，经过长达2–25个月的每日Hexa Z 氢气纳米气泡水浴后，预浴CRP水平从5.31 mg/dL降至0.24 mg/dL，处于标准范围内，一些病例的可见炎症症状得到了缓解。因此，具有高密度纳米气泡的Hexa Z 氢气纳米气泡水浴对血清抗氧化能力、炎症和皮肤外观有益。

UFB水表现出还原活性并产生抗氧化自由基，因此这种水可以有效地治疗特应性皮炎和预防包括糖尿病和癌症在内的生活方式相关疾病。UFB氢气水具有抗氧化功能，因此，它可能被用于预防所谓的生活方式相关疾病，包括高血压、高脂血症、糖尿病、心脏病和脑梗塞以及当今老龄化社会中不断增加的癌症。具有优异储存稳定性的UFB氢气水预计将在未来需要进一步的精细气泡，用于学术和商业领域，如医学、动物学、植物学、生命科学、无机化学、电子学、原子物理学以及各种制造和清洁行业。

四、材料与方法

UFB氢气水的制备：根据先前的报告，使用具有共振起泡和真空空化的生产系统从去离子水中制备UFB氢气水[9]。以下展示了一种通过共振起泡和真空空化的微细气泡水生产方法的有效方法（图4）。水被主泵5加压并送到共振喷射器10，共振喷射器10和共振起泡装置12中的减压通过观察减压表11和气体流量计8同时调整共振调节针阀9，而在共振喷射器10中混合的气液混合物在共振起泡装置12中通过类似于长笛原理的共振混合。起泡“共振起泡”是通过在整个水系统中产生真空来进行的，以生成微气泡并在共振喷射器10之后立即通过次级泵14的吸力（大于主泵5和共振喷射器10排出的水体积）使气泡膨胀。通过真空和空化进一步将由共振喷射器12生成的初级微细气泡破碎成更小的气泡，从而产生真空空化超细气泡水。为了生产UFB氢气水，需要使用共振气泡形成和真空空化。共振气泡形成是执行的，以便来自主泵的水被转移到共振喷射器，吸入气体与水混合，使用真空表和针阀调整压力条件，并且在共振气泡形成装置中对气液混合物进行共振以形成微细气泡。真空空化是通过使用两个泵，主泵和次级泵进行的，其中次级泵的性能优于主泵，以便产生适当的减压状态。仅共振起泡处理和结合共振起泡和真空空化处理的气泡中空气含量的比较结果的典型测量如表3所示。单独的共振起泡处理会使材料的整个表面变得模糊，而结合真空空化处理时则变为无色透明。这是因为在共振起泡处理中产生了微气泡，但通过立即进行真空空化处理，微气泡被粉碎并变成UFBs。此外，比较了气泡形式的气体分散、水中注入气体的分散率和处理后1小时水中的气体含量，显示仅共振起泡处理的值下降到大约40–25%，而结合处理方法的值在处理后立即得到维持。

图4. UFB氢气水生产系统（带有共振起泡和真空空化）的示意图。图中每个数字的解释如下：1:水源，2:导水管，3:电源插座，4:电力线，5:主泵，6:喷射器，7:进气口，8:低压流量气体流量计，9:共振调节针阀，10:共振喷射器，11:共振调节真空表，12:共振起泡装置，13:初级微气泡处理后的水输送管，14:次级泵，15:次级泵电机，16:超细气泡增压器，17:设备支撑框架，18:移动轮，19:空气超细气泡水储存罐，20:氢气供应单元（氢气瓶），21:主阀，22:气压表，23:减压阀，24:减压后气体流量计，25:气体流量计，26:气体针阀，27:气体脱臭和过滤系统，28:清洁气体输送管，29:UFB氢气水储存罐。还显示了虚线框区域放大视图。

表3. 仅通过共振起泡或结合共振起泡和真空空化产生的气泡中混合的空气量的比较结果。

UFB颗粒的浓度分析由NANOX（北九州市，日本）进行。

测量ORP和抗氧化自由基：为了测量氢水的氧化还原电位（ORP），使用具有0.8至1.0特斯拉强磁场的氢自由基水循环搅拌器，将氢气以50 mL/min的流量添加到纯水中，并在高速旋转（3000 rpm）下搅拌10分钟，生成UFB氢水。此外，作为对照，也制备了没有添加磁化功能的纯水和简单UFB氢水，并使用Eh计（Five Go F1, Mettler Toledo, Greifensee, 瑞士）测量了ORP值。

抗氧化自由基是通过DPPH（Nacalai Tesque, Inc., 京都，日本）自由基清除活性测定法根据之前的报告[27,28]测量的。简而言之，通过使用分光光度计在520 nm波长处测量吸光度来颜色测定法确定氧化自由基的消除能力，该反应是紫色氧化DPPH与超细氢水泡水反应形成无色还原DPPH。上述UFB氢水和DPPH溶液混合，使DPPH的最终浓度分别为1.96、3.85、5.67、9.09、75、100和150 μM。自由基清除率（%）确定为对照与样品测量值的比率。

此外，使用去离子水制备pH 3和pH 4的柠檬酸水溶液，并使用上述方法生成UFB氢水。制备DPPH自由基溶液，使其最终浓度为9.09 μM，并测量从pH 3和pH 4柠檬酸溶液或普通去离子水中生成的UFB氢水的自由基清除能力。

关于UFB氢水的热稳定性测试，将UFB氢水在沸水中加热10、20、30和40分钟，然后在冷却后的水中冷却，分析DPPH自由基清除能力。

五. 结论

我们开发了一种通过使用直径小于1μm的UFBs将氢气分散在水中来生产更稳定的氢水的方法。发现UFB氢水即使在室温下长时间储存在聚对苯二甲酸乙酯容器中也是稳定的，并且其自由基清除能力至少保持三个月。这意味着它可以稳定储存一定时期，使其可以在各种领域中使用。

六. 专利

美国专利。Kamimura等，专利号：US 10,500,553 B2，专利日期：2019年12月10日。通过共振起泡和真空空化制造具有氧化自由基或还原自由基的超细气泡的方法，以及超细气泡水制造装置。