氢化镁对扑热息痛诱导肾损伤的治疗作用机制对乙酰氨基酚（APAP）诱导的急性肾损伤（APAP-AKI）已成为临床获得性肾功能不全的原因之一。作为固态氢源的氢化镁（MgH2）可能在临床实践中具有潜在应用。当前研究旨在探究MgH2对APAP-AKI的保护作用。结果显示，MgH2改善了APAP-AKI小鼠的肾功能和组织学损伤。MgH2还对HK-2细胞中APAP诱导的细胞毒性具有保护作用。此外，MgH2处理降低了APAP诱导的反应性氧物质（ROS）水平的增加以及炎症因子（TNF-α和IL-1β）和促凋亡因子（Bad、Bax、Caspase3和CytC）的表达。进一步地，与TXNIP/NLRP3/NF-κB通路相关的分子（TXNIP、NLRP3、NF-κB p65和p-NF-κB p65）在肾组织和HK-2细胞中的表达通过APAP过量增强，而这些通过MgH2给药减少。总之，这项研究表明，MgH2通过抑制TXNIP/NLRP3/NF-κB信号通路，减轻氧化应激、炎症和凋亡，从而保护APAP-AKI。 

Si Y, Liu L, Zhang Y, Li H, Zhao T, Liu S, Sun X, Cheng J, Lu H. Magnesium hydride protects against acetaminophen-induced acute kidney injury by inhibiting TXNIP/NLRP3/nf-κb pathway. Ren Fail. 2024 Dec;46(1):2330629. 

1. 前言

乙酰氨基酚（APAP），也称为扑热息痛，通常在临床实践中用作镇痛和退热剂。然而，过度、联合或长期用药可能导致显著的肝脏和肾脏损伤，甚至死亡。先前的调查显示，大约1-12%的APAP过量患者会出现肾功能不全[引用文献1-3]。APAP诱导的急性肾损伤（APAP-AKI）的机制非常复杂，需要进一步研究。已有报告指出氧化应激、炎症反应、线粒体功能障碍、细胞凋亡、内质网应激以及肾小球血流动力学变化都与此过程有关[引用文献4]。氧化应激是导致APAP-AKI的最关键和直接因素之一。在治疗剂量下，APAP被细胞色素P450代谢成N-乙酰-对苯醌亚胺（NAPQI），然后被谷胱甘肽（GSH）还原。过量的APAP导致NAPQI水平升高和GSH耗尽，导致内源性活性氧（ROS）积累。ROS将进一步启动不同信号的炎症反应和细胞凋亡，促进APAP-AKI[引用文献5,6]。一些具有抗氧化作用的天然产品可以阐明对APAP-AKI的保护作用[引用文献7]。然而，缺乏针对APAP-AKI的特效解毒剂。为此，深入了解APAP-AKI的机制将有助于开发针对性的治疗方法。

硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）已被证明是连接氧化应激与炎症小体激活的关键信号分子[引用文献8]。先前的研究发现，TXNIP/NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体的激活与APAP诱导的肝损伤的发展有关。具体来说，APAP诱导的ROS过量产生促进了TXNIP从TRX-1分离并进一步连接到NLRP3炎症小体，加剧了肝脏损伤。此外，这种情况可以通过核因子-红细胞生成素2相关因子2（Nrf2）激活来抑制[引用文献9]。Nrf2属于亮氨酸拉链家族，是一种重要的调节氧化应激的转录因子。Nrf2诱导抑制TXNIP/NLRP3信号不仅与ROS的消除有关，而且还增强了TRX-1的转录[引用文献10]。已有报告称，Nrf2的诱导在体内和体外模型中对APAP-AKI进展中的氧化应激、炎症和细胞凋亡具有保护作用[引用文献4,11]。此外，NLRP3炎症小体的激活存在于APAP-AKI中，而抑制NLRP3可以减轻肾脏损伤[引用文献12]。然而，尚未明确TXNIP及其介导的信号在APAP-AKI中是否发挥重要作用。

氢分子（H2），一种能够有效穿透细胞膜和其他细胞器的小型分子，在多个系统的许多疾病中发挥着多种生物学效应，包括抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡和抗纤维化[引用文献13]。先前的研究已经证明H2可以保护由顺铂、铁尼草酸三钠、环孢素A、败血症、草酸盐和甘油诱导的肾损伤[引用文献14-19]。到目前为止，还没有关于H2对APAP-AKI保护作用的报道。镁氢化物（MgH2）作为一种固态H2源，具有高的储氢能力，可以通过水解反应产生所需量的H2[引用文献20]。由于副产品无毒，因此有可能在临床实践中将MgH2用于生物应用。因此，本研究调查了MgH2对APAP-AKI中氧化应激、炎症和细胞凋亡的预防效果。我们假设MgH2通过抑制TXNIP/NLRP3信号减轻APAP-AKI。

2. 材料与方法

2.1. 动物实验

八周龄的雄性C57BL/6小鼠（n=24）购自上海SLAC实验室动物有限公司（中国上海），并在实验室环境中适应一周。小鼠在受控条件下饲养，温度25±2°C，湿度55±5%，12小时光照/黑暗周期，并可自由获取食物和自来水。动物实验方案由海军军医大学医学研究伦理委员会批准（编号：NMUMREC-2021–006）。

小鼠随机分为四组：第1组（对照组，n=6）通过胃管给予等量的等渗盐水连续3天，并在第三天通过腹腔注射（i.p.）给予等量的等渗盐水；第2组（APAP组，n=6）通过胃管给予等量的等渗盐水连续3天，并在第三天给予APAP（500mg/kg, i.p.）；第3组[低剂量MgH2（LMH）组，n=6]通过胃管给予低剂量MgH2（50mg/kg）连续3天，并在第三天给予APAP；第4组[高剂量MgH2（HMH）组，n=6]通过胃管给予高剂量MgH2（100mg/kg）连续3天，并在第三天给予APAP。

APAP购自MedChem Express（中国上海），MgH2购自武汉新材料科技有限公司（中国武汉）。实验结束时，所有小鼠均被麻醉。通过眼球取血采集血液，并在3000rpm离心10分钟后获得血清，存储于−80°C。原位心脏灌注后，立即取出右肾并存储于−80°C。接着，取出左肾并用10%缓冲福尔马林固定。

2.2. 生化指标的测定

血清肌酐（SCr）和血尿素氮（BUN）的水平分别通过肌酐试剂盒和尿素试剂盒（建成生物工程，中国）检测。

2.3. 组织学和免疫组织化学染色

用10%缓冲福尔马林固定的肾脏样本包埋在石蜡中，并以4μm厚度切片进行苏木精-伊红（HE）染色。对于Masson染色，水合切片使用Masson三色染色试剂盒（Servicebio，中国）按照制造商的说明进行染色。周期性酸-雪夫（PAS）染色使用周期性酸-雪夫染色试剂盒（Servicebio，中国）按照供应商的说明进行。对于免疫组织化学分析，切片在95°C下用柠檬酸抗原修复液孵育20分钟。之后，切片在4°C下与TXNIP（1:200，Cloud-Clone，中国）和磷酸化核因子-κB (NF-κB) p65（1:200，Cell Signaling Technology，USA）的一抗过夜孵育，然后在37°C下与HRP标记的山羊抗兔抗体（1:500，Proteintech，USA）孵育50分钟。最后，切片用二氨基苯肼染色并用苏木精复染。 

2.4 末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口标记（TUNEL）检测

使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术，中国）进行TUNEL检测。肾切片先用蛋白酶K（20 mg/mL）在37°C下预处理20分钟，然后用PBS洗涤三次，接着在37°C的暗室中与TUNEL反应混合液孵育1小时。然后使用共聚焦显微镜观察阳性染色。

2.5 细胞培养和处理

人肾近端小管上皮细胞系（HK-2）购自美国菌种保藏中心（ATCC, USA）。HK-2细胞用补充了10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12（DMEM/F12; HyClone, USA）培养，并在37°C、5% CO2培养箱中孵化。细胞分为四组：（1）对照组用PBS按指定浓度和时间处理；（2）APAP组用PBS预处理24小时，再与APAP（10 mM）共孵育24小时；（3）LMH组在应用APAP前24小时用低剂量MgH2（0.2 mM）处理；（4）HMH组在应用APAP前24小时用高剂量MgH2（0.4 mM）处理。APAP和MgH2的浓度基于Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测结果选择。

2.6 细胞活力测试

使用CCK-8（耶森生物技术，中国）检测细胞活力。将HK-2细胞以每孔2000个细胞的密度接种于96孔板中，然后在培养24小时后分别用PBS、APAP、MgH2或APAP和MgH2进行处理。每孔加入约10 μL CCK8试剂，并在37°C下孵育2小时。使用微孔板读数器在450 nm波长处测量光密度（OD）值。

2.7 线粒体膜电位（MMP）检测

使用JC-1检测试剂盒（MedChemExpress, USA）测定HK-2细胞中的MMP水平。细胞用PBS洗涤后，在37°C暗处用JC-1染色30分钟。随后，HK-2细胞用PBS洗两次，使用共聚焦显微镜观察并拍摄荧光图像。在正常状态下，JC-1在线粒体基质中聚集形成聚合物，产生红色荧光信号；当MMP水平下降时，JC-1解聚成单体，产生绿色荧光。采用红绿荧光比来评估MMP水平的变化。

2.8 免疫荧光

HK-2细胞在37°C下用4%甲醛固定15分钟，用PBS洗涤，并用0.3% Triton X-100透化10分钟。在5% BSA中阻断30分钟后，样本与TXNIP（1:200）和p-NF-κB p65（1:200）的一抗在4°C下过夜免疫标记。细胞洗涤后，进一步在37°C暗处与Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔抗体（1:500, Abcam, UK）孵育1小时。用DAPI（碧云天生物技术，中国）在室温下复染核10分钟。使用共聚焦显微镜观察并拍摄荧光图像。

2.9 活性氧（ROS）水平检测

使用二氢乙锭（DHE；碧云天生物技术，中国）检测肾脏中的细胞内ROS水平。将肾样本用PBS洗涤两次，并在37°C下与20 μM DHE稀释在2 mL无血清DMEM中避光孵育。30分钟后，处理过的肾组织用PBS洗三次。用DAPI复染核，并使用共聚焦显微镜拍摄切片的数字图像。采用氧化敏感荧光探针2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA；碧云天生物技术，中国）来测量HK-2细胞中的ROS水平。简言之，细胞与10 μM DCFH-DA在37 °C下孵育30分钟，然后用无血清培养基洗三次。在共聚焦显微镜下观察HK-2细胞的荧光强度。

 2.10 蛋白质印迹（Western blotting）分析

使用含有苯甲基磺酰氟（PMSF）、磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（KeyGEN, 中国）提取细胞和肾脏组织的蛋白质。等量的蛋白质样品加载到10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上，然后转移到硝酸纤维素滤膜（GE Healthcare Life Sciences, UK）。在5%牛血清中阻断2小时后，膜在4°C下与一抗孵育过夜，抗体包括中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL; 1:1000）、肾损伤分子-1（KIM-1; 1:1000）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS; 1:1000）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α；1:1000）、白细胞介素-1β（IL-1β；1:1000）、Bcl2拮抗剂（Bad; 1:1000）、Bcl2相关X蛋白（Bax; 1:1000）、Caspase3（1:1000）、细胞色素C（CytC; 1:1000）、TXNIP（1:1000）、NLRP3（1:1000）、NF-κB p65（1:1000）、p-NF-κB p65（1:1000）、β-肌动蛋白（β-Actin; 1:1000）、β-微管蛋白（β-Tubulin; 1:1000）和GAPDH（1:1000）。然后膜用吐温20/Tris缓冲盐溶液（TBST）洗三次，并与二抗（LI-COR Biosciences, USA）在室温下孵育2小时。用TBST洗三次后，可通过Odyssey荧光成像系统（LI-COR Biosciences, USA）检测二抗的荧光信号。 

2.11 逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

使用TRIzol试剂（Invitrogen, USA）按照制造商的说明从肾组织中分离总RNA。通过260/280 nm吸光度确定RNA浓度和纯度。使用逆转录试剂盒（Vazyme, China）将RNA逆转录成cDNA。在SYBR Green PCR试剂盒（Yeasen Biotechnology, China）中确定TNF-α和IL-1β的表达。引物序列如下：TNF-α：正向：5′-CTCGAACCCCGAGTGACAAG-3′ 和反向：5′-TATCTCTCAGCTCCACGCCA-3′；IL-1β：正向：5′-GCTTCAGGCAGGCAGTATCA-3′ 和反向：5′-AGTCACAGAGGATGGGCTCT-3′。 

2.12 统计分析

实验数据以均值±标准误差（SEM）表示，并使用SPSS 22.0统计软件（SPSS Inc., USA）进行分析。两组间比较采用学生t检验。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey's post-test。p值小于0.05被认为具有统计学意义。

3 研究结果

3.1. MgH2改善了APAP诱导的肾损伤

与对照组相比，小鼠血清中的SCr和BUN水平在APAP组显著升高。相比之下，这些生物标志物的水平在使用低剂量和高剂量MgH2给药后显著降低（图1(A,B)）。对照组中肾脏的HE染色结果显示，肾脏结构完整，每个细胞的形态都正常。在APAP组中，观察到明显的肾脏变化，如小管扩张、变性、坏死以及上皮细胞脱落。MgH2给药改善了APAP诱导的肾脏组织损伤（图1(C)）。Masson染色显示，与对照组相比，APAP组中小管间质和肾小球中胶原纤维的沉积明显增加，这可以通过高剂量MgH2给药来减少（图1(D)）。PAS染色的结果表明，由APAP引起的蛋白质排泄和小管上皮断裂通过低剂量和高剂量MgH2给药得到了改善（图1(E)）。作为肾损伤的新生物标志物，分析了小鼠肾脏中KIM-1和NGAL蛋白的表达。与对照组相比，APAP组中KIM-1和NGAL的表达增强，这通过低剂量和高剂量MgH2给药得到了下调（图1(F)）。

图1. MgH2改善了APAP诱导的小鼠肾功能障碍、组织学损伤和氧化应激。

(A, B) 通过相应的试剂盒测定了小鼠血清中的SCr和BUN水平。(C–E) 通过HE染色(C)、Masson染色(D)和PAS染色(E)观察了小鼠肾脏的组织学变化。(F, G) 通过Western blot检测了小鼠肾脏中NGAL、KIM-1和iNOS的蛋白表达。(H) 使用DHE检测了小鼠肾脏组织中的细胞内ROS水平。结果以均值±标准误差表示。统计比较采用Newman-Keuls检验（*p < 0.05 对比对照组，#p < 0.05 对比APAP组）。

3.2. MgH2通过抑制氧化应激、炎症和凋亡减轻APAP-AKI

作为氧化应激标志物之一的肾脏中iNOS蛋白表达在APAP组较对照组增加，而MgH2给药后降低（图1(G)）。小鼠肾脏中的细胞内ROS水平通过肾切片中的红色荧光显示。荧光显示，由APAP引起的小鼠肾脏中增加的ROS产生在使用MgH2给药后减少（图1(H)）。在炎症指标方面，与对照组相比，小鼠肾脏中TNF-α和IL-1β的mRNA表达在APAP组上调，而MgH2给药后逆转了这一趋势（图2(A,B)）。同样地，western blot显示，由APAP引起的肾脏中TNF-α和IL-1β蛋白表达的增加在使用低剂量和高剂量MgH2给药后减少（图2(C)）。通过western blot检测了小鼠肾脏中的Bad、Bax、Caspase3和CytC蛋白表达以反映凋亡。结果表明，APAP增强了Bad、Bax、Caspase3和CytC蛋白表达，而使用低剂量和高剂量MgH2给药后这些表达减弱（图2(D)）。此外，我们对肾组织进行了TUNEL染色以检测凋亡，并发现APAP组出现了TUNEL阳性小管细胞，但MgH2给药后这些细胞的数量减少（图2(E)）。

图2. MgH2改善了APAP诱导的小鼠肾脏炎症和凋亡。

(A, B) 通过RT-qPCR检测了小鼠肾脏中TNF-α和IL-1β的mRNA表达。(C, D) 通过western blot检测了小鼠肾脏中TNF-α、IL-1β、Bad、Bax、Caspase3和CytC的蛋白表达。(E) 通过TUNEL染色观察了小鼠肾脏中的小管细胞凋亡。结果以均值±标准误差表示。统计比较采用Newman-Keuls检验（*p < 0.05 对比对照组，#p < 0.05 对比APAP组）。

3.3. MgH2保护HK-2细胞免受APAP诱导的细胞毒性

为了观察MgH2的治疗效果，我们建立了HK-2细胞的APAP诱导细胞毒性模型。首先，我们用不同浓度的MgH2（10、20、50、100、200、400、600、800和1000 μM）处理HK-2细胞，并发现在最大浓度1 mM MgH2下细胞活力基本不变（图3(A)）。然后，用不同浓度的APAP（5、10、20、40、60、80、100 mM）处理HK-2细胞，随着APAP浓度的增加，细胞活力降低。我们的数据显示，5 mM APAP对HK-2细胞具有细胞毒性，并确定了MgH2（0.2和0.4 mM）对APAP诱导的细胞活力降低的保护效果（图3(B,C)）。此外，由APAP诱导的HK-2细胞中KIM-1蛋白表达的增加在使用MgH2给药后减少（图3(F)）。

图3. MgH2缓解了APAP诱导的HK-2细胞毒性、氧化应激、线粒体功能障碍和炎症。

(A-C) 通过CCK-8检测法检测HK-2细胞活力。(A) 用不同浓度的MgH2（10、20、50、100、200、400、600、800和1000 μM）处理HK-2细胞；(B) 用不同浓度的APAP（5、10、20、40、60、80、100 mM）处理HK-2细胞，有或无MgH2（0.4 mM）；(C) 用APAP（10 mM）处理HK-2细胞，有或无MgH2（0.2、0.4 mM）。(D) 通过DCFH-DA测定HK-2细胞中的ROS水平。(E) 通过JC-1染色评估HK-2细胞的线粒体功能。(F, G) 通过western blot检测HK-2细胞中iNOS、KIM-1和IL-1β的蛋白表达。结果以均值±标准误差表示。统计比较采用t检验（*p < 0.05 对比APAP组）或Newman-Keuls检验（*p < 0.05 对比对照组，#p < 0.05 对比APAP组）。

3.4. MgH2保护HK-2细胞免受APAP诱导的氧化应激、炎症和凋亡

与对照组相比，HK-2细胞中的ROS水平在APAP组显著升高。MgH2给药后，ROS水平显著下调（图3(D)）。此外，HK-2细胞中iNOS和TNF-α的蛋白表达在APAP组较对照组增加，MgH2给药后减少（图3(F,G)）。通过JC-1染色评估的MMP水平用于评估HK-2细胞的凋亡。值得注意的是，将HK-2细胞暴露于APAP会导致MMP水平降低，而MgH2给药后低剂量和高剂量均能使MMP水平恢复到接近正常水平（图3(E)）。

3.5. MgH2通过抑制TXNIP/NLRP3/NF-κB通路在体外和体内减轻APAP诱导的肾毒性

研究评估了TXNIP/NLRP3/NF-κB信号通路是否参与了MgH2对APAP-AKI的作用。在体外，通过western blot检测TXNIP/NLRP3/NF-κB信号中分子的蛋白表达。与对照组相比，HK-2细胞中TXNIP、NLRP3、p-NF-κB p65和NF-κB p65的表达在APAP组增强，MgH2给药后下调（图4(A)）。免疫荧光也表明，由APAP诱导的增加的TXNIP和p-NF-κB p65表达在MgH2给药后低剂量和高剂量均被抑制（图4(B,C)）。在小鼠APAP-AKI模型中，western blot结果表明，与对照组相比，APAP组中TXNIP、NLRP3、p-NF-κB p65和NF-κB p65的表达上调。但是，这些分子的表达通过低剂量和高剂量MgH2给药得到逆转（图5(A)）。同样，免疫组织化学显示，由APAP引起的TXNIP和p-NF-κB p65表达增加在MgH2给药后减少（图5(B,C)）。

图4. MgH2抑制了HK-2细胞中APAP诱导的TXNIP/NLRP3/NF-κB信号通路激活。

(A) 通过western blot检测HK-2细胞中TXNIP、NLRP3、NF-κB p65和p-NF-κB p65的蛋白表达。(B, C) 通过免疫荧光分析检测HK-2细胞中TXNIP和p-NF-κB p65的蛋白表达。

图5. MgH2抑制了小鼠肾脏中APAP诱导的TXNIP/NLRP3/NF-κB信号通路激活。 

(A) 通过western blot检测小鼠肾脏中TXNIP、NLRP3、NF-κB p65和p-NF-κB p65的蛋白表达。 (B, C) 通过免疫组织化学染色检测小鼠肾脏中TXNIP和p-NF-κB p65的蛋白表达。

 4. 讨论

APAP是一种广泛使用的解热镇痛非处方药，其在治疗剂量下具有较宽的安全范围。然而，由于个体差异，它容易被滥用，过量使用可能导致危及生命的肾损伤[引用1]。因为最有效的一线解毒剂N-乙酰半胱氨酸无法完全抵御肾毒性[引用3]，所以APAP-AKI的临床治疗极为有限。因此，迫切需要替代的、安全的、更广泛应用的药物来预防或治疗APAP-AKI。在本研究中，我们关注了MgH2对APAP-AKI的保护作用及其潜在的分子机制。

APAP诱导的肾功能不全与急性小管坏死一致，因为APAP可以直接作用于近端小管。这种损伤表明APAP可以作为药物诱导的AKI模型[引用4]。与SCr和BUN相比，KIM-1和NGAL被认为是AKI中更敏感和可靠的生物标志物[引用21,引用22]。我们的结果证明，在APAP-AKI中血清中SCr和BUN的水平以及KIM-1和NGAL的表达上调，而MgH2预处理显著逆转了这一现象。此外，肾脏组织病理学反映MgH2减轻了小管损伤，表明MgH2有效缓解了APAP-AKI。

通常，APAP诱导的肾毒性经常与氧化应激有关。由APAP过量产生的NAPQI水平升高导致GSH耗竭，从而在肾脏中产生细胞内ROS[引用1]（图6）。在我们的研究中，结果显示体内外APAP-AKI模型中的细胞内ROS水平显著升高，这也得到了之前研究的支持[引用2,引用12]。有报道称，H2不仅可以选择性地抑制氧自由基，还可以增强抗氧化酶活性和基因表达以减轻氧化应激[引用23,引用24]。MgH2可以在胃中通过水解反应产生H2：MgH2 + 2H2O → Mg(OH)2 + 2H2。我们的结果表明，MgH2预处理改善了APAP诱导的肾脏氧化应激。

图6. MgH2通过抑制TXNIP/NLRP3/NF-κB通路保护免受APAP-AKI。APAP过量导致NAPQI水平升高和GSH耗竭，从而导致肾脏ROS产生增加。ROS可以导致线粒体功能障碍并激活TXNIP/NLRP3/NF-κB信号通路，导致凋亡和炎症。此外，TXNIP可以进一步加剧ROS积累和氧化应激。MgH2可能通过抑制TXNIP/NLRP3/NF-κB通路改善氧化应激、炎症和纤维化，从而缓解APAP-AKI。

在APAP过量的情况下，肾脏中GSH的耗竭导致NAPQI与线粒体蛋白结合，从而导致线粒体功能障碍，进而破坏线粒体膜的渗透性[引用25]。一方面，线粒体功能障碍可以进一步加速肾脏中氧化应激的发展。另一方面，线粒体功能障碍可以增加线粒体相关凋亡蛋白如Bax和Caspase3的表达[引用26]。之前的研究已经证明，在APAP-AKI中存在线粒体功能障碍和增加的凋亡基因表达[引用5,引用12]，这与我们的研究结果一致。具体来说，研究结果显示，APAP给药后小管细胞中的MMP水平降低，而肾组织中的凋亡细胞和凋亡蛋白的表达增加。有报道称，H2可以保持正常的线粒体功能以缓解凋亡[引用27]。此外，H2处理可以通过抑制凋亡在不同病因因素的肾损伤中提供保护[引用19,引用28]。在我们的研究中，由于MgH2补充导致的肾脏中凋亡基因表达的抑制和凋亡细胞的减少是一些其他有趣的发现。

越来越多的证据表明，炎症也是APAP诱导的肾脏病理发生的原因。此外，APAP过量引起的ROS过度产生可以进一步激发或加剧炎症，促使APAP-AKI的形成[引用5]。在这项研究中，我们观察到，包括TNF-α和IL-1β在内的炎症细胞因子的表达因过度APAP处理而增加。我们的发现与早期的报告一致，表明抑制炎症可能为APAP-AKI提供一种可能的治疗[引用2,引用12]。抗炎特性被视为H2的特点之一。已经有报道称，H2疗法可以减少不同肾脏疾病中炎症细胞因子的水平，并提高抗炎细胞因子的水平[引用17,引用18,引用29]。在目前的研究中，我们发现MgH2处理减轻了APAP诱导的肾炎症。TXNIP是TRX的内源性抑制剂和调节器，TRX是一种主要的细胞抗氧化和抗凋亡蛋白。TXNIP的过度表达抑制了TRX的活性，因此可以调节细胞的氧化还原状态并刺激氧化应激[引用30]。此外，TXNIP表达的变化调节了它影响其他一些生物过程的能力。首先，TXNIP通过调节NLRP3炎症小体的激活和IL1β的成熟，在炎症过程中的发展中起着至关重要的作用。其次，TXNIP可以通过与氧化还原无关的途径促进细胞凋亡。第三，TXNIP作为一种代谢调节剂发挥着重要作用[引用31]。NLRP3炎症小体的激活已经涉及到各种肾脏疾病。NLRP3炎症小体的形成可以增加参与肾损伤病理过程的cleaved Caspase-1和IL-1β的表达[引用30,引用32]。转录因子NF-κB在氧化应激反应中被触发，然后转移到细胞核并促进TNF-α和IL-1β的转录[引用33]。此外，NLRP3炎症小体可以加速NF-κB的激活并促进NF-κB介导的炎症反应[引用34]。已经证明，TXNIP介导的NLRP3炎症小体激活参与了APAP诱导的肝损伤[引用9,引用35]。我们的工作发现，在过量APAP处理的肾组织和HK-2细胞中，TXNIP、NLRP3和NF-κB的表达增加。我们推测，过量APAP产生的ROS可以导致线粒体功能障碍并激活TXNIP/NLRP3/NF-κB信号通路，从而导致凋亡和炎症。此外，TXNIP可以加剧ROS的积累和氧化应激（图6）。之前的研究表明，H2处理可以通过抑制NLRP3途径来缓解心肌缺血再灌注损伤和败血症相关脑病[引用36,引用37]。在我们的研究中，我们观察到MgH2下调了APAP诱导的TXNIP、NLRP3和NF-κB的增加表达，这表明MgH2可能通过调节TXNIP/NLRP3/NF-κB通路改善APAP-AKI（图6）。

然而，这项研究存在一些局限性。由于H2迅速而广泛地扩散，目前还没有有效的方法来检测H2在体外和体内的扩散。此外，H2的直接靶标仍然不清楚，因此需要进一步的实验研究来检测水合作用在细胞和动物中的具体机制。尽管如此，我们的研究可以为进一步探索MgH2对抗APAP-AKI的肾脏保护作用提供基础。

5. 结论

本研究表明，MgH2可以有效缓解APAP诱导的肾损伤中的氧化应激、炎症和凋亡。其潜在机制是TXNIP/NLRP3/NF-κB通路的失活。因此，我们的研究为MgH2在预防和治疗APAP-AKI中的应用提供了新的证据。