可注射型产氢气菌水凝胶：用于啮齿类动物与猪模型的心脏修复

目前各类疗法对缺血/再灌注（I/R）损伤的心脏保护效果均有限，核心难题在于如何及时有效调控氧化应激、同时维持线粒体正常功能。氢气（H₂）可选择性清除毒性氧自由基，参与机体生理与病理过程的调控。但氢气疗法的疗效高度依赖释氢量与释氢速率，因此研发快速、简易、高效的产氢技术至关重要。本研究将光合细菌（PSB）封装于可注射猪真皮细胞外基质（ECM）水凝胶中，用于修复心脏缺血/再灌注损伤。该光合细菌水凝胶经光照后可持续大量产氢，维持线粒体稳态与正常生理功能。在猪心脏缺血/再灌注损伤模型中，该水凝胶能有效减轻心肌损伤、挽救濒死心肌。本研究认为，这种光合产氢细菌疗法有望成为缺血/再灌注相关疾病的新型治疗手段。

心肌缺血是全球发病率和致死率最高的疾病之一。即便及时、顺利地完成再灌注治疗，目前仍缺乏有效手段保护心肌细胞，阻止可逆性缺血/再灌注损伤向不可逆损伤转变。缺血组织恢复供氧后会生成大量活性氧（ROS），尤其是芬顿反应产生的毒性羟自由基，会破坏线粒体结构、损害其功能。线粒体受损会扰乱心肌细胞能量代谢，进而破坏心肌细胞结构，最终造成不可逆的心肌损伤与心功能障碍。

现阶段靶向线粒体的抗氧化疗法种类不断增多，包括线粒体靶向抗氧化剂、超氧自由基清除剂、二氧化铈纳米材料等。这类物质理论上可清除过量活性氧、减轻损伤，但临床试验效果并不理想，临床应用受到极大限制。主要难点有两点：一是难以精准将纳米药物递送并富集至心肌靶组织；二是心脏内复杂的生物环境会影响纳米药物的稳定性与生物活性。

已有研究证实，氢气可作为靶向线粒体的治疗性抗氧化剂。它能选择性缓解羟自由基引发的细胞毒性，且不影响其他活性氧的正常生理功能，可有效减轻脑部缺血/再灌注损伤。饮用富氢水等氢气相关疗法，在临床试验中已被证实有助于减轻慢性炎症、缓解氧化应激、减少细胞损伤。不过氢气疗法仍存在明显短板：氢气水溶性差、体内释氢量不足、释放过程难以精准调控，大幅限制了实际疗效。

光合细菌可通过光合作用产氢，相关研究已较为成熟，具备长效作用的潜力。基于这一思路，本研究选用沼泽红假单胞菌（一种光合细菌）用于心脏修复。该菌种生物相容性好、生物安全性高，且可在光照下稳定、长效地产氢。为避免光合细菌被机体快速清除，研究采用细胞外基质水凝胶对其进行包封，实现氢气在心肌损伤部位局部、持续释放，针对性治疗心肌缺血/再灌注损伤。细胞外基质水凝胶不仅具备理想力学性能，还可将细菌限定在凝胶内部，减轻局部炎症反应。

本研究首先利用斑马鱼、大鼠开展细胞毒性实验，验证光合细菌水凝胶的生物相容性与生物安全性；随后检测不同光源、光照强度下水凝胶的长期产氢能力，并评价其抗氧化应激效果。通过检测线粒体膜电位、线粒体功能、体积密度及形态，证实氢气可修复线粒体分裂与融合紊乱。除啮齿类动物模型外，本研究还选用巴马小型猪这一大型动物模型验证疗效。实验通过球囊导管封堵冠状动脉75分钟构建心肌梗死模型，随后松开球囊再灌注180分钟。猪模型实验结果表明，该光合细菌水凝胶可有效缓解氧化应激造成的细胞损伤、提升心肌细胞存活率，促进心脏修复。上述结果为心脏缺血/再灌注损伤的临床防治提供了新方向（图1a、h）。

 实验结果

 一、产氢光合细菌水凝胶的制备与表征

细胞外基质水凝胶是组织工程中递送各类药剂的理想载体。本研究首先制备了猪源细胞外基质水凝胶（扩展图1a）。对浓度为1、2.5、5、7.5、10毫克/毫升的水凝胶进行扫描电镜（SEM）观测，发现所有样品均呈多孔结构；水凝胶浓度越高，结构越致密（扩展图1b）。不同浓度水凝胶的纤维直径、节点密度无明显差异（扩展图1c–e），但浓度会影响凝胶黏度、粘附性与力学强度（扩展图1f）。

流变学测试结果显示，水凝胶的储能模量（G'）与损耗模量（G''）会随应变、频率、温度发生变化；整体规律为：细胞外基质浓度越高，凝胶交联程度越高（扩展图1g）。高浓度凝胶触变性更强，低浓度凝胶的屈服应力更低（扩展图1h、i）。综合各项性能指标，最终确定5毫克/毫升为水凝胶的最优基质浓度（扩展图1j、k）。

研究进一步优化光合细菌浓度与光照强度：将不同浓度光合细菌与5毫克/毫升细胞外基质水凝胶混合后，置于10000~11000勒克斯氙灯下照射，采用氧化滴定法检测产氢量。结果显示，当光合浓度达到1\times10^8菌落单位/毫升后，继续提高菌浓度，产氢量不再同步上升；同时在实验范围内，光照强度变化也未对产氢量产生显著影响（扩展图2a–e）。

本研究采用Transwell共培养体系（孔径0.4微米）开展抗氧化实验：将光合细菌置于上室，下室为缺氧损伤的H9c2心肌细胞，该孔径仅允许氢气自由扩散。使用二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针检测细胞内活性氧水平。结果显示，当光合细菌浓度≥1\times10^8菌落单位/毫升时，细胞绿色荧光显著减弱，证明氢气可有效降低胞内活性氧含量（扩展图2f–h）。后续实验统一选用1\times10^8菌落单位/毫升的菌浓度、10000~11000勒克斯光照强度。

将光合细菌复合入水凝胶后再次进行流变学检测，发现凝胶储能模量与损耗模量提升一个数量级，说明细菌掺入提高了凝胶交联密度与力学强度。考虑到该水凝胶需微创注射至心包腔，本研究全面评估其黏弹性与触变性。如图1b所示，该水凝胶属于非牛顿流体，具备剪切稀化（假塑性）特性；当外力超过屈服应力（108.5帕）后发生塑性变形，同时具备良好自修复能力，黏度可在30秒内恢复至平衡状态。结合流体黏度、注射管路、流速等参数计算，注射所需最大压力为150.875帕，高于凝胶屈服应力，证明该水凝胶注射难度低，满足临床微创注射要求。

扫描电镜结果显示（放大20000倍），光合细菌紧密附着在细胞外基质纤维表面、嵌于凝胶微结构内部（图1c），可大幅减少细菌逃逸，延长其在心肌损伤部位的滞留时间。利用共聚焦显微镜追踪细菌运动轨迹：游离光合细菌运动杂乱无章，而经水凝胶包封后，细菌运动被限制在凝胶网络内（图1d、补充视频1），运动范围显著缩小。

实验同时探究间歇光照下的产氢能力：样品强光照射30分钟后避光15分钟，仍可检测到持续产氢（图1e）。结合超声成像进一步验证氢气释放（图1f、补充视频2）。

缺血/再灌注损伤发生后需及时干预氧化应激。Transwell实验结果表明：光合细菌水凝胶经光照后，10分钟内即可显著降低受损H9c2细胞的活性氧水平，30分钟后胞内活性氧恢复至正常范围（图1g）。

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