氢化钯纳米颗粒构建热-氢协同体系高效抗肿瘤治疗

 摘要

光热纳米材料凭借优异的光热转换性能，在肿瘤治疗领域备受关注。但单纯光热治疗往往无法彻底消融肿瘤组织。为提升治疗效果，本文构建热-氢协同治疗策略，利用氢化钯（PdH）纳米颗粒将光热升温与氢气调控氧化应激相结合。本研究采用化学法合成氢化钯纳米颗粒，并借助透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）、紫外-可见分光光度计及热响应测试对其进行系统表征。结果表明，该氢化钯纳米颗粒粒径小、结构稳定性强、分散性良好；当浓度为100微克/毫升时，光热转换效率可达61.9%。借助亚甲基蓝褪色实验证实，在532纳米激光照射下，该材料可释放氢气。体外实验显示，激光辐照时，氢化钯纳米颗粒能够持续、稳定地释放氢气，提升细胞内氧化应激水平，进而选择性诱导肝癌细胞凋亡，同时对正常肝细胞无明显损伤。该体系可使肝癌细胞死亡率达到82%，治疗效果远优于单纯钯纳米颗粒。上述结果证实了热-氢协同作用的机制优势，也说明氢化钯纳米颗粒有望成为一种可精准调控、具有细胞选择性的肿瘤治疗平台。

 1. 引言

氢气长期以来被视作清洁能源，但其生物医学价值直到2007年才被发掘：大泽等人发现氢气具有选择性抗氧化特性。此后大量研究证实，氢气可选择性清除活性氧（ROS），且不会干扰机体必需的信号自由基，从而减轻神经退行性疾病（阿尔茨海默病、帕金森病）、代谢性疾病（代谢综合征、糖尿病、线粒体病）引发的氧化损伤。除此之外，氢气还具备良好的抗炎活性。慢性炎症与活性氧累积是肿瘤发生发展的重要诱因，因此氢气的抗炎、抗氧化特性使其在肿瘤预防与治疗中具备应用潜力。

传统氢气给药方式包括直接吸入、饮用富氢水、注射富氢生理盐水等，普遍存在靶向性差、气体易扩散的缺陷。而纳米技术能够实现氢气的可控储存、靶向递送与定点释放。纳米载体比表面积大，且易于进行表面功能修饰，可在外场（磁场、电场、激光等）刺激下定点释放氢气，实现病灶部位按需释氢。

钯（Pd）纳米颗粒不仅储氢能力优异，也是光热治疗中常用的光热转换材料，拥有出色的光热性能。利用钯等等离子体纳米材料开展光热治疗，可通过激光诱导局部高温实现无创肿瘤消融，应用前景广阔。但单一光热治疗难以彻底清除全部肿瘤细胞，还可能诱发炎症反应，促使肿瘤细胞再生，最终降低治疗效果。已有研究表明，单纯钯纳米颗粒虽具备光热活性，但体外杀伤肿瘤细胞的效率偏低。因此，将抗炎策略与肿瘤光热治疗相结合，兼具必要性与实际效果。

目前已报道的钯纳米颗粒合成方法大多流程复杂，且需使用具有毒性的化学试剂。例如部分工艺以硼氢化钠等强还原剂快速诱导晶核形成，再结合晶种生长法制备颗粒，步骤繁琐且反应条件要求严苛；而溶剂热法合成钯纳米颗粒则需要高温高压反应釜，反应周期最长可达约20小时。

近年来，热-氢协同治疗成为新兴研究方向，该策略既能降低光热治疗的副作用，又能进一步提升抗肿瘤效果。已有研究将该疗法应用于宫颈癌治疗，并取得良好成效；例如羧甲基纤维素包覆铁基释氢纳米药物（Fe@CMC）已被证实可选择性杀伤肿瘤细胞。这种双重作用机制可提升肿瘤部位活性氧水平、降低药物全身暴露风险，进而放大治疗效果。

本研究制备了粒径均一的氢化钯纳米颗粒，用于肿瘤靶向热-氢协同治疗。该合成方法工艺简单、成本低廉、反应周期短，便于规模化制备与实验重复。文中系统表征了氢化钯纳米颗粒的结构、储氢量与光热性能；光热实验证明其光热稳定性优异，可耐受长时间、反复激光照射，且光热转换效率高。通过亚甲基蓝实验验证：在激光刺激、温度低于生物损伤临界值（60 ℃）的条件下，该材料可实现氢气可控释放。

本研究以人肝癌细胞与正常肝细胞为模型，从细胞活性、活/死细胞染色、胞内活性氧水平等维度，评价氢化钯纳米颗粒的体外治疗效果与作用机制。实验结果显示，激光辐照下，氢化钯纳米颗粒可选择性杀伤肝癌细胞，对正常肝细胞影响极小，在消融肿瘤细胞的同时实现正常组织保护。同等实验条件下对照单纯钯纳米颗粒，证实氢化钯对肿瘤细胞的选择性细胞毒性显著增强。氢化钯兼具光热效应与可控释氢能力，二者产生协同作用，为肿瘤治疗提供了新思路，也具备后续体内实验转化的潜力。

 2. 实验方法

 2.1 钯纳米颗粒与氢化钯纳米颗粒的制备

 2.1.1 钯纳米颗粒的制备

采用简易化学合成法制备钯纳米颗粒。向圆底烧瓶中加入57 mg 四氯合钯酸钠（Na₂PdCl₄）、106 mg 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、60 mg 抗坏血酸（AA）与300 mg 溴化钾（KBr），再加入11 mL 去离子水，持续搅拌至固体完全溶解，得到红棕色溶液。将反应烧瓶连接回流冷凝管，固定于磁力加热搅拌器上，置于油浴锅中，80 ℃搅拌反应3小时。反应过程中溶液颜色逐渐加深，证明钯纳米颗粒成功生成。

体系冷却至室温后，使用截留分子量100 kDa的超滤管，以3660转/分钟的转速离心30分钟，收集胶体产物；随后用去离子水洗涤3次。将纯化后的钯纳米颗粒重新分散于10 mL 去离子水中，避光、4 ℃冷藏保存。

 2.1.2 氢化钯纳米颗粒的制备

取上述钯纳米颗粒分散液，转移至20 mL 样品瓶中，用橡胶塞密封。样品瓶一端连接氢气发生器出气口，另一端插针头与大气相通，用于缓慢排出多余氢气；氢气发生器通气速率为500毫升/分钟。持续通氢气30分钟，完成钯纳米颗粒的氢化改性。密封样品瓶并用铝箔避光，将氢化钯分散液转移至铝箔包裹的密封离心管中，冷藏待用。整个操作在室温下进行，以保证材料充分吸氢。（图1）

 图1 热-氢协同治疗原理示意图

 2.2 材料表征

表征前，对纳米颗粒分散液进行超滤纯化，并用去离子水反复洗涤，尽可能去除游离聚乙烯吡咯烷酮与残留反应物。（图2）

 图2 材料合成流程示意图

 2.2.1 透射电子显微镜（TEM）测试

采用赛默飞Talos-F200X型透射电子显微镜观测材料形貌。取适量钯、氢化钯纳米颗粒溶液，滴加至碳膜铜网表面，自然晾干后，利用高分辨透射电镜观察微观形貌。

 2.2.2 X射线衍射（XRD）分析

使用布鲁克D8 ADVANCE A25型X射线粉末衍射仪分析样品物相。将待测溶液滴于载玻片上自然风干，采用铜靶Kα射线（波长λ=1.54056 埃），扫描范围0°~90°，步长0.02°/秒，采集衍射数据。

 2.2.3 紫外-可见吸收光谱测试

采用珀金埃尔默Lambda950型紫外-可见分光光度计，测试浓度为30微克/毫升的钯、氢化钯纳米颗粒溶液的紫外-可见-近红外吸收光谱。室温下，取3 mL 样品溶液置于光程10 mm的石英比色皿中，扫描范围200~1100纳米，记录吸光度。

 2.2.4 动态光散射（DLS）与zeta电位测试

使用马尔文Zetasizer Nano ZS90型粒度仪测试样品粒径与表面电位。恒温25 ℃，对钯、氢化钯纳米颗粒溶液各扫描60次，每组实验重复3次，取平均值并生成检测报告。

 2.3 氢化钯纳米颗粒稳定性测试

将氢化钯水溶液低温静置保存。分别将氢化钯纳米颗粒分散于去离子水、磷酸盐缓冲液（PBS）、细胞培养液中，在第1、3、5、7、14天依次检测样品的粒径与zeta电位，评价材料长期稳定性。

 2.4 光热性能测试

采用532纳米绿色激光对纳米颗粒进行光热性能测试。取1 mL 样品溶液置于内径10 mm的石英比色皿中，设置特定功率密度（1.0 瓦/平方厘米），连续激光照射5分钟；激光参数参考现有热-氢相关研究的常用范围。照射结束后，样品自然冷却至室温。

实验全程使用功率计校准并监测激光功率；利用菲力尔SC620型红外热成像仪，每20秒实时记录溶液温度变化。参照罗珀等人报道的方法，计算氢化钯纳米颗粒的光热转换效率。

给定激光功率与样品浓度下，光热转换效率计算公式如下：

（公式1）

式中：η_T 为光热转换效率；Tmax 为氢化钯溶液最高温度（℃）；Tr 为环境温度（℃）；I为激光功率（W）；Bλ为样品在532纳米处的吸光度；Qd 为纯水在激光照射下的吸热速率（J/s）；h 为体系传热系数；S为石英比色皿的表面积。

传热系数与表面积的乘积 $hS$ 由公式（2）计算：

（公式2）

式中：m 为氢化钯溶液质量（g）；CH 为水的比热容；τm为时间常数，可通过公式（3）求得：

（公式3）

式中：t 为溶液冷却时长（s）；θ为热驱动常数；T为t时刻溶液温度（℃）；Tmax、Tr 定义同上。时间常数τm由线性拟合得到。

 2.5 释氢性能检测

采用亚甲基蓝褪色实验评价氢化钯的释氢能力：一定条件下，氢气可还原亚甲基蓝使其褪色，以此间接表征氢气释放量。

配制浓度为1、1.5、3、5、8、10 微克/毫升的亚甲基蓝溶液，各取3 mL 置于光程10 mm的石英比色皿中，检测664纳米处吸光度，绘制吸光度-亚甲基蓝浓度标准曲线。

释氢实验分为两组：①新鲜氢化钯溶液，经532纳米激光（1.0 瓦/平方厘米）照射；②避光冷藏14天的氢化钯溶液，经相同参数激光照射。每组总检测时长60分钟，分别在0、3、5、10、20、30、40、60分钟取样测试。混合体系总体积3 mL，其中氢化钯纳米颗粒浓度3 微克/毫升，亚甲基蓝浓度5 微克/毫升。

为进一步区分钯与氢化钯，利用铂对氢氧化反应的催化活性开展原位电化学测试。以微盘电极为工作电极、金属丝电极为对电极、银/氯化银电极为参比电极，构建标准三电极体系；实验在水浴控温条件下进行。测试前向体系通入氮气10分钟，去除溶解氧；实验过程中持续通入低速氮气保护。

 2.6 细胞培养

将人正常肝细胞（LO2）、人肝癌细胞（HepG2、SMMC-7721）分别接种于96孔板。细胞采用高糖达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）培养，培养基添加10%胎牛血清、100 单位/毫升青霉素、100 微克/毫升链霉素。培养环境：37 ℃、5%二氧化碳、相对湿度90%的恒温培养箱。使用质量分数0.25%胰蛋白酶溶液进行细胞传代消化。

实验细胞株均购自中国科学院典型培养物保藏中心；胎牛血清购自赛默飞世尔科技公司。

 2.7 体外细胞毒性实验

设置激光照射组与无激光对照组，分别加入不同浓度的氢化钯纳米颗粒（0、25、50、100、150、200、400 微克/毫升）。激光组采用532纳米激光（1.0 瓦/平方厘米）照射5分钟，对照组不作处理；同步设置单纯钯纳米颗粒平行对照实验。

处理结束后，用无菌磷酸盐缓冲液清洗细胞3次（每次150 μL），去除残留纳米颗粒，更换新鲜培养基。加入浓度5毫克/升的CCK-8试剂，孵育2小时后，使用酶标仪检测450纳米处吸光度，以未处理组为参照计算细胞存活率。

 2.8 活/死细胞染色与胞内活性氧检测

采用钙黄绿素-AM/碘化丙啶（Calcein-AM/PI）双染法检测细胞活性。选取0、50、150 微克/毫升三个代表性浓度的氢化钯、钯纳米颗粒处理正常肝细胞（LO2）与肝癌细胞（HepG2、SMMC-7721）；每个浓度均分为激光照射组与空白组，激光参数同上。通过荧光成像判定细胞状态：凋亡细胞发出红色荧光，正常活细胞发出绿色荧光，根据荧光比例与强度评价细胞存活情况。

采用二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针检测胞内活性氧水平。细胞分组、给药、激光处理条件与活死染色实验一致。所有样品在相同显微镜参数下拍摄荧光图像，利用徕卡SP8共聚焦显微镜及配套LAS X软件进行定量分析；扣除背景信号后，选取目标区域，以有效像素灰度值的算术平均值计算平均荧光强度，结果以相对DCF荧光强度表示。

 2.9 统计学分析

所有实验均独立重复3次，采用统计学软件进行数据分析。p < 0.05、p < 0.01、p < 0.001 分别代表差异具有统计学意义、显著统计学意义、极显著统计学意义。

 3. 结果与讨论

 3.1 钯与氢化钯纳米颗粒的材料表征

利用透射电子显微镜表征化学合成的钯、氢化钯纳米颗粒形貌（图3A、3B）。钯纳米颗粒呈立方状，粒径均一，约30纳米；包覆剂聚乙烯吡咯烷酮可有效调控颗粒形貌，使钯颗粒具备良好分散性。氢化钯纳米颗粒（图3B）保持与原料钯一致的立方形貌及均匀粒径，无明显团聚现象。二者形貌、尺寸相近，说明吸氢过程不会造成颗粒烧结或形貌改变。

动态光散射测试结果显示，两种纳米颗粒粒径均分布在10~100纳米区间，平均粒径30纳米；氢化钯粒径略大于钯，证明氢气成功载入颗粒内部。

如图3D所示，两种颗粒的zeta电位绝对值相近、电性相反：钯纳米颗粒晶格中无氢原子，电子无法顺利脱离，表面带正电（+18 毫伏）；氢化钯表面带负电（−19 毫伏）。氢化后颗粒电位发生反转，进一步证实氢原子成功嵌入钯晶格，钯纳米颗粒氢化改性完成。

 图3 钯与氢化钯纳米颗粒表征结果

 (A) 钯纳米颗粒透射电镜图（比例尺：100 nm）；(B) 氢化钯纳米颗粒透射电镜图（比例尺：100 nm）；(C) 两种颗粒的粒径分布；(D) zeta电位；(E) 氢化钯分散于水中1/3/5/7/14天的粒径变化；(F) 氢化钯分散于水中1/3/5/7/14天的zeta电位变化；(G) X射线衍射图谱；(H) 紫外-可见吸收光谱

为评价氢化钯纳米颗粒的稳定性，将其分别分散于去离子水、磷酸盐缓冲液、细胞培养液中，连续14天监测粒径与zeta电位（图3E、3F）。两周内，样品的粒径、表面电位基本保持稳定，说明该材料在模拟生理环境中结构稳定性优异，颗粒不易团聚、氢气不易泄漏。该特性是其生物医学应用的重要基础，可保证材料在体内转运至病灶部位的过程中稳定储氢。

利用X射线衍射（XRD）分析表征了钯纳米颗粒与氢化钯纳米颗粒的物相结构（图3G）。在20°~90°的衍射角范围内，两种颗粒的XRD曲线均出现四个明显特征衍射峰，证明二者均为立方晶型结构。氢化钯纳米颗粒各衍射峰对应的特征参数高于钯纳米颗粒。这一结果说明：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可对纳米颗粒实现有效修饰，同时氢原子已成功嵌入钯纳米颗粒的晶格之中。

图3H为钯与氢化钯纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱。两种材料的吸收曲线均随波长向近红外区域延伸而逐渐下降。二者在紫外波段的吸光度相近，但在可见光与近红外波段存在明显差异；其中氢化钯在近红外区的吸光度更强。在532纳米波长处，氢化钯的吸光度同样高于钯，进一步证实钯纳米颗粒成功完成载氢处理。该结果与已有文献结论一致：在532纳米附近，氢化钯的吸光度普遍高于钯纳米颗粒。

为验证元素分布情况，本研究对钯、氢化钯纳米颗粒开展高角环形暗场成像（HAADF）与能谱分析（EDS），结果如图4所示。由HAADF图像（图4A、4B）可见，钯元素在立方状颗粒内部分布均匀。两种材料的能谱图（图4C、4D）均出现两处典型的钯元素特征峰，且峰形差异极小。综合以上结果可确定：钯与氢化钯纳米颗粒中钯元素分布均一，二者核心区别在于氢化钯的晶格中储存了氢原子。

 图4 钯与氢化钯纳米颗粒的高角环形暗场成像及能谱图

 (A) 钯纳米颗粒高角环形暗场图：右侧为颗粒外部形貌，左侧为内部元素分布，中间为两者叠加图；

 (B) 氢化钯纳米颗粒高角环形暗场图：右侧为颗粒外部形貌，左侧为内部元素分布，中间为两者叠加图；

 (C) 钯纳米颗粒能谱图；(D) 氢化钯纳米颗粒能谱图。

 3.2 氢化钯纳米颗粒的光热效应

氢化钯纳米颗粒具备优异的光吸收能力与水分散性，因此本研究进一步探究其在532纳米激光照射下的光热转换性能。图5A为相同浓度、相同激光功率密度条件下，氢化钯、钯纳米颗粒与纯水的光热升温曲线。随着激光照射时间延长，氢化钯与钯纳米颗粒体系温度均逐步升高，且氢化钯的升温幅度略高于钯纳米颗粒；而纯水仅升温4.2 ℃。这说明激光本身对溶剂的加热作用可忽略不计，氢化钯溶液的升温效应完全来自纳米颗粒的光热作用，也证明氢化钯纳米颗粒拥有优异的光热转换能力。

 图5 氢化钯纳米颗粒的光热性能

 (A) 相同浓度（100微克/毫升）、相同功率密度（1瓦/平方厘米）下，钯纳米颗粒、氢化钯纳米颗粒与纯水的光热升温曲线；

 (B) 浓度为50微克/毫升的氢化钯水溶液，在不同激光功率密度（0.25、0.5、0.75、1.0、1.5瓦/平方厘米）下的升温曲线；

 (C) 相同激光功率密度（1瓦/平方厘米）、相同体积下，不同浓度（0、25、50、100、150、200微克/毫升）氢化钯水溶液的升温曲线；

 (D) 相同功率密度下，浓度100微克/毫升的氢化钯纳米颗粒与纯水的光热升温曲线；

 (E) 浓度100微克/毫升、激光功率密度1瓦/平方厘米条件下，氢化钯纳米颗粒的光热升温曲线；

 (F) 降温阶段热驱动力自然对数与时间的线性拟合曲线。

随后本研究探究了颗粒浓度与激光功率密度对氢化钯升温效果的影响。如图5B所示，在颗粒浓度恒定的前提下，将激光功率从0.25瓦/平方厘米提升至1.5瓦/平方厘米，体系升温速率与最终温度均随之升高。保持激光功率不变、逐步增大颗粒浓度，溶液温度快速上升，升温区间为5 ℃至50 ℃（图5C）。上述规律表明：可通过调控颗粒用量与激光强度，灵活调节氢化钯的光热升温效果；颗粒浓度越高、激光能量越大，升温速率越快，体系最终温度也越高。红外热成像结果直观展现了氢化钯优异的光热性能：在相同532纳米激光照射下，氢化钯悬浮液呈现明显热信号，而纯水无明显热响应。

结合图5E、5F的温度变化曲线可知，氢化钯纳米颗粒可实现显著升温。激光照射后，氢化钯溶液温度由室温25.1 ℃升至45.8 ℃，总温差达20.7 ℃；经计算，该体系的时间常数（τm）为411.958秒。依据前文光热转换效率公式计算得出，该氢化钯纳米颗粒的光热转换效率可达61.9%，远高于文献中报道的同类氢化钯材料36%的光热转换效率。

 3.3 氢化钯纳米颗粒的热响应释氢行为

为验证激光照射能否触发纳米颗粒释放氢气，本研究采用亚甲基蓝分析法开展检测——氢气可还原亚甲基蓝并使其褪色。如图6A所示，以664纳米特征吸收峰的吸光度为指标，建立亚甲基蓝浓度与吸光度的标准曲线（图6B），用于后续实验定量分析。

 图6 亚甲基蓝溶液的光谱吸收特征

 (A) 不同浓度亚甲基蓝溶液的紫外-可见吸收光谱；

 (B) 亚甲基蓝溶液在664纳米处的浓度-吸光度标准曲线及拟合方程。

如图7A、7B所示，新鲜制备的氢化钯纳米颗粒，以及在低温避光条件下储存14天的氢化钯纳米颗粒，二者对应的混合溶液吸收光谱特征高度一致，664纳米处吸光度变化规律相近，证明该材料储氢稳定性优异。结合图7C定量结果：两组样品最终释氢量分别为0.00913微摩尔、0.00874微摩尔。这表明即便经过长期储存，氢化钯纳米颗粒仍可保持稳定的释氢性能。

 图7 氢化钯纳米颗粒的光控释氢性能

 (A) 新鲜氢化钯与亚甲基蓝混合溶液在不同照射时长下的紫外-可见吸收光谱；

 (B) 避光储存14天的氢化钯与亚甲基蓝混合溶液在不同照射时长下的紫外-可见吸收光谱；

 (C) 不同组别氢化钯纳米颗粒的释氢定量分析结果；

 (D) 钯纳米颗粒溶液的循环伏安曲线；(E) 氢化钯纳米颗粒溶液的循环伏安曲线。

为进一步验证氢化钯的载氢能力，本研究开展原位电化学测试。图7D、7E分别为钯溶液与氢化钯溶液的循环伏安曲线。对比发现，氢化钯溶液在−0.25伏处出现明显氧化峰，而钯溶液无对应特征峰，该结果直接证明氢原子成功负载于氢化钯纳米颗粒中。

综合各组实验结果可证实：氢化钯是一种性能优异的储氢材料。在低于60 ℃（生物损伤临界温度）的条件下，借助激光刺激即可实现氢气可控释放。该特性使氢化钯在需要安全、定点释氢的生物医学领域具备良好应用前景。

 3.4 氢化钯介导热-氢协同增强抗肿瘤效果：与钯纳米颗粒的对比评价

本研究首先评估了氢化钯纳米颗粒对正常肝细胞（LO2）与肝癌细胞（HepG2、SMMC-7721）的细胞相容性，结果见图8A–C。在无激光照射时，实验浓度范围内的氢化钯纳米颗粒对正常肝细胞与肝癌细胞均无明显毒性。

施加532纳米激光照射后（图8A）：当氢化钯浓度为100~150微克/毫升时，正常肝细胞LO2存活率仍维持在较高水平；浓度升至150微克/毫升时，细胞存活率约为60%；仅当浓度达到200微克/毫升时，细胞存活率才明显下降至26%。这说明中等浓度氢化钯联合光热处理，对正常细胞损伤极小。

与之相反，肝癌细胞SMMC-7721与HepG2对“氢化钯+激光”处理更为敏感：氢化钯浓度仅为50微克/毫升时，两种肝癌细胞的存活率便开始下降；浓度升至100微克/毫升时，细胞存活率大幅降低至30%以下；浓度达到200微克/毫升时，细胞存活率不足10%，绝大多数肝癌细胞被杀伤。以上结果表明：激光照射下，氢化钯纳米颗粒可选择性杀伤肝癌细胞，同时对正常肝细胞影响较小。其中，200微克/毫升氢化钯联合激光处理，对SMMC-7721细胞的杀伤率超90%，对HepG2细胞的杀伤率超70%。

 图8 细胞相容性检测结果

 (A) 不同浓度氢化钯作用下LO2细胞存活率；(B) 不同浓度氢化钯作用下SMMC-7721细胞存活率；(C) 不同浓度氢化钯作用下HepG2细胞存活率；

 (D) 不同浓度钯纳米颗粒作用下LO2细胞存活率；(E) 不同浓度钯纳米颗粒作用下SMMC-7721细胞存活率；(F) 不同浓度钯纳米颗粒作用下HepG2细胞存活率。

为证实上述效果来源于氢化钯的载氢特性，本研究在相同激光条件下，使用纯钯纳米颗粒开展平行对照实验（图8D–F）。结果显示：激光照射下，纯钯纳米颗粒对两种肝癌细胞的杀伤作用十分有限。即便浓度高达200微克/毫升，SMMC-7721细胞存活率仍有约40%，HepG2细胞存活率更是高达80%。对于正常肝细胞LO2，当钯浓度低于100微克/毫升时细胞存活率较高，浓度升至150微克/毫升时，存活率降至约40%。钯与氢化钯的实验差异充分证明：氢气在热-氢协同抗肿瘤体系中起到关键作用。

随后本研究对处理后的细胞进行活/死细胞染色实验（图9）。结合光热实验结果，选取0、50、150微克/毫升三个氢化钯浓度开展实验。对于正常肝细胞LO2：无论是否施加激光照射、是否加入氢化钯，视野内几乎均为绿色荧光，代表细胞基本全部存活。定量结果（图9B）显示，各组LO2细胞存活率接近100%，与细胞活性实验结论一致，即该实验浓度下氢化钯对正常细胞几乎无损伤。

 图9 不同条件下氢化钯处理三种细胞的活/死细胞染色结果

 (A) 不同浓度氢化钯联合/不联合532纳米激光处理人正常肝细胞与肝癌细胞的活/死染色荧光图（比例尺：100微米）；

 (B–D) 不同浓度氢化钯作用下，LO2、HepG2、SMMC-7721细胞红绿荧光定量结果；数据以平均值±标准差表示（n=3）。

对于肝癌细胞HepG2：仅加入氢化钯、不进行激光照射时，视野内以绿色荧光为主，说明单独氢化钯不会显著影响细胞存活；仅施加激光、不加氢化钯时，出现少量红色荧光，代表仅有少量细胞死亡。当氢化钯浓度为50微克/毫升时，死细胞数量增多，活细胞比例降至44%；浓度升至150微克/毫升时，细胞大量死亡，活细胞比例仅为18%。这证明激光与氢化钯联用可有效杀伤HepG2细胞，且杀伤效果呈浓度依赖性，与CCK-8细胞活性检测结果相吻合。

SMMC-7721细胞的活/死染色结果（图9A、9D）同样显示，治疗效果与材料浓度呈正相关。当氢化钯浓度为150微克/毫升时，对SMMC-7721细胞的杀伤率可达82%，抗肿瘤效果显著提升。

作为对照，本研究同时完成了纯钯纳米颗粒的活/死细胞染色实验（图10）。结果表明：无论是否施加激光照射、无论浓度高低，纯钯纳米颗粒对正常细胞与肝癌细胞均无明显毒性。定量分析（图10B–D）显示，即便钯浓度达到150微克/毫升，两种肝癌细胞的最低存活率仍维持在80%左右。

 图10 不同条件下钯纳米颗粒处理三种细胞的活/死细胞染色结果

 (A) 不同浓度钯纳米颗粒联合/不联合532纳米激光处理人正常肝细胞与肝癌细胞的活/死染色荧光图（比例尺：100微米）；

 (B–D) 不同浓度钯纳米颗粒作用下，LO2、HepG2、SMMC-7721细胞红绿荧光定量结果；数据以平均值±标准差表示（n=3）。

综合图9、图10的细胞活性实验与活/死染色结果可知：氢化钯可实现氢气疗法与光热疗法的协同增效。需要说明的是，CCK-8实验与活/死染色反映的细胞评价指标不同：CCK-8主要检测细胞脱氢酶活性（代谢水平），活/死染色则反映检测时间点的细胞膜完整性。单纯钯纳米颗粒介导的光热胁迫会降低细胞代谢活性，但细胞膜仍保持完整。以上结果进一步印证了热-氢协同治疗的优越性与应用潜力：光热效应杀伤肿瘤细胞，同时氢气可选择性作用于肿瘤细胞、保护正常细胞免受氧化损伤，最终实现对癌细胞的靶向毒性作用。

 3.5 氢化钯纳米颗粒对细胞内活性氧水平的影响

为阐明热-氢协同疗法选择性杀伤肿瘤细胞的作用机制，本研究检测了各组细胞内的活性氧（ROS）水平。结合细胞相容性实验结果，选取0、50、150微克/毫升三个浓度的氢化钯、钯纳米颗粒，共计六组样本，探究两种材料及热-氢协同作用对胞内活性氧的影响。

如图11A、11B所示：无激光照射时，正常肝细胞LO2的胞内活性氧水平极低，为细胞正常代谢本底水平；单独加入氢化钯，也不会造成LO2细胞内活性氧异常累积。施加激光照射后，荧光强度略有上升，代表胞内活性氧小幅增加；随着氢化钯浓度升高，活性氧水平缓慢上升，但整体仍维持在低位。有趣的是，相同氢化钯浓度下，激光组细胞的活性氧水平反而低于无激光组。这说明氢化钯可对正常细胞起到保护作用，抑制活性氧过度累积，降低细胞凋亡风险。

 图11 不同浓度氢化钯处理下三种细胞的活性氧染色结果

 (A) 联合/不联合532纳米激光处理后，人正常肝细胞与肝癌细胞的活性氧荧光图（比例尺：100微米）；

 (B–D) 不同浓度氢化钯作用下，LO2、HepG2、SMMC-7721细胞的活性氧定量结果；数据以平均值±标准差表示（n=3）。

肝癌细胞经氢化钯处理后，活性氧变化规律与正常细胞完全不同（图12A、12C-D）。无激光照射时，单纯加入氢化钯便会使HepG2细胞内活性氧小幅升高；施加激光后，所有浓度组的活性氧均大幅激增。仅用激光、不加氢化钯时，细胞活性氧也会上升，体现出光热胁迫的影响；随着氢化钯浓度增大，活性氧水平进一步显著提升。当氢化钯浓度为150微克/毫升并联合激光照射时，HepG2细胞活性氧水平较空白组提升5.08倍，SMMC-7721细胞活性氧水平提升3.10倍。

上述数据证明：热-氢协同治疗可在肿瘤细胞内诱发剧烈氧化应激，而活性氧过量累积是细胞死亡的重要诱因——过量活性氧会打破细胞氧化还原稳态，最终导致细胞凋亡。

 图12 三种细胞的活性氧染色及定量结果

 (A) 不同浓度钯纳米颗粒联合/不联合532纳米激光处理后，人正常肝细胞与肝癌细胞的活性氧荧光图（比例尺：100微米）；

 (B) 不同浓度钯纳米颗粒作用下LO2细胞活性氧定量结果；

 (C) 不同浓度钯纳米颗粒作用下HepG2细胞活性氧定量结果；

 (D) 不同浓度钯纳米颗粒作用下SMMC-7721细胞活性氧定量结果；数据以平均值±标准差表示（n=3）。

为明确氢气的作用，本研究同步对比了纯钯纳米颗粒处理组的胞内活性氧水平（图12A、12B）。结果显示：随着钯浓度升高，正常肝细胞LO2的胞内活性氧逐步上升，激光照射会进一步加剧活性氧生成；两种肝癌细胞也呈现相同趋势。对比可见：钯处理组中，正常肝细胞的活性氧水平远高于氢化钯处理组，而肝癌细胞的活性氧水平则低于氢化钯处理组。

结合图11、12可得氢化钯的双重优势：第一，选择性抑制正常肝细胞内活性氧累积，避免氧化应激引发细胞凋亡；第二，大幅提升肿瘤细胞的氧化应激水平，诱导肿瘤细胞大规模凋亡，这一效果是单纯钯纳米颗粒无法实现的。实验同时观察到两种肝癌细胞均出现线粒体损伤（附图S1），提示热-氢处理引发的氧化应激具有细胞选择性，且与线粒体功能紊乱相关，其深层抗肿瘤机制仍有待进一步探究。

现有研究表明，肿瘤组织特有的酸性微环境可进一步促进氢气释放，从而增强治疗效果。这也再次佐证了热-氢协同治疗策略的优势。与已报道的同类热-氢治疗体系相比，本研究构建的载氢平台制备工艺大幅简化，无需复杂的多组分修饰。综上，该治疗策略在生物医学领域具备良好的应用前景。

 4. 结论

本研究构建了基于氢化钯纳米颗粒的治疗平台，通过热-氢协同作用实现肿瘤细胞氧化应激的协同增强。所制备的氢化钯纳米颗粒光热转换效率高，且可耐受长时间激光照射，光热稳定性良好。释氢实验证实，该材料可在60 ℃（生物损伤临界温度）以下实现氢气可控释放。

无激光照射时，氢化钯纳米颗粒对正常肝细胞与肝癌细胞均具备良好生物相容性；激光刺激下，该材料可显著提升肿瘤细胞内活性氧水平、诱导细胞凋亡，同时维持正常细胞的活性氧稳态。肿瘤细胞在强氧化应激作用下，杀伤率可达82%。作为对照，单纯钯纳米颗粒既无法有效保护正常肝细胞，也不能对肝癌细胞产生显著杀伤效果。

综上，氢化钯纳米颗粒可实现可控、靶向的肿瘤治疗，大幅降低脱靶副作用，也为后续临床前动物模型研究奠定了基础。

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