基于壳聚糖与百里香酚的协同抗菌作用，湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所、武汉理工大学环境生态与生物工程学院Huang Liqi等将壳聚糖-百里香酚乳液应用于水产品保鲜。通过制备壳聚糖-百里香酚、大豆分离蛋白和豆油复合乳液，利用该复合乳液对大口黑鲈鱼片进行保鲜研究，探讨大口黑鲈鱼片贮藏过程中优势腐败菌与异味化合物之间的潜在关联，为大口黑鲈的保鲜及水产品低温物流运输的应用提供参考。

Introduction

鱼虾等水产品富含蛋白质（15%～20%）且水分含量高（70%～80%），因此易受外界污染而导致腐败。水产品的风味变化主要由蛋白质氧化、脂质氧化、微生物降解以及内源酶作用引起。微生物的繁殖是食品腐败变质的主要原因。这是因为微生物的活动更容易导致水产品风味劣变和品质快速下降，这主要是由于微生物蛋白酶将蛋白质水解为肽和氨基酸，释放的氨基酸可转化为酮类、硫化物等物质。而分解脂肪的微生物也能产生脂肪酶，将脂肪水解为甘油和脂肪酸，进而因氧化产生醛、酮、醇、酸、酯等物质，影响水产品的风味。因此，分析水产品中腐败微生物群与风味变化之间的相关性，对于维持预制水产品的品质具有重要意义。

通常，保持水产品新鲜的主要方法是通过物理、化学或生物手段干预水产品的腐败过程，从而延缓水产品的腐败。然而，单一的物理保鲜有其局限性，例如对风味和感官品质的损害、孢子灭活的局限性以及较高的设备成本。化学方法是一种有效手段，但部分合成化学防腐剂对人类健康和环境污染存在潜在威胁。生物方法是从动物、植物和微生物中获取高效、无害且无污染的天然产物，可用于延长食品的保质期。许多已知的生物防腐剂已被用于研究，例如精油、植物天然提取物、酶、细菌素、生物活性肽、罗伊氏菌素、有机酸、聚赖氨酸和益生菌等。

壳聚糖是自然界中发现的唯一碱性多糖，它可通过干扰细胞膜蛋白的合成来影响磷脂分子并改变细胞膜的流动性和电位，降低细胞膜中信号因子吲哚的酶活性、疏水性和代谢，从而抑制微生物的生长。由于其良好的抗菌性能，壳聚糖已被证明可作为肉类、蔬菜和水果等食品的防腐剂。通过研究6 种不同分子质量的壳聚糖和壳聚糖低聚物对几种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑制活性，发现壳聚糖具有比低聚糖更高的抗菌活性，其对革兰氏阳性菌的灭活效果优于革兰氏阴性菌。 

百里香酚，是百里香、罗勒、薄荷等植物挥发油的主要活性成分，具有良好的抗炎、镇痛、杀虫、抑菌、抗氧化和抗肿瘤功能。目前，关于百里香酚的物理化学性质、抗菌机制、生物活性、化学合成、封装和递送方面的研究已取得很大进展。然而，关于百里香酚及其复合防腐剂用于水产品保鲜的研究较少。

基于其来源广泛和强大的抗菌特性，壳聚糖已成为合成防腐剂的天然替代品。如上所述，关于壳聚糖在水产品保鲜中的应用已有许多报道。然而，单一防腐剂存在抗菌谱窄等局限性；须将2 种或多种防腐剂按一定比例复配。这不仅可以拓宽抗菌谱、提高保鲜效果，还可以减少每种防腐剂的用量，从而降低生产成本。其次，由于国内冷链物流基础设施尚不完善，有必要探讨大口黑鲈在非冷藏温度下的品质变化。

Results

1 挥发性盐基氮含量

随着贮藏时间延长，CK组（对照组）和CT组（实验组）的总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量均逐渐增加。CK组在第3天达到31.49 mg/100 g，已发生腐败；CT组在第20天为19.85 mg/100 g，接近腐败阈值。添加0.5%壳聚糖和1%百里香酚的复合乳液能有效延缓TVB-N含量的上升。CK组在第3天即腐败，而CT组可将货架期延长至20 d。

图2 大口黑鲈鱼片的TVB-N含量

2 好氧菌落总数

随着贮藏时间延长，两组的好氧菌落总数均逐渐增加。根据中国国家标准GB 2733–2015，好氧菌落总数＞6 （lg （CFU/g））即视为腐败。CK组在第2天达到6.81（lg （CFU/g）），已超过腐败阈值；CT组则可将货架期延长至16 d。复合乳液显著抑制了鱼肉中好氧菌的生长。

图3 大口黑鲈鱼片的好氧菌落总数

3 pH值

本实验中，两组的pH整体呈上升趋势。pH值的逐渐上升主要是由于鱼肉腐败微生物增加，以及通过内源酶促蛋白质水解产生了氨、胺等碱性物质。早期厌氧呼吸产生的乳酸较少，未对整体趋势产生明显影响。

图4 大口黑鲈鱼片的pH值

4 生物胺含量

腐败菌在赖氨酸脱羧（产生尸胺）和鸟氨酸脱羧（产生腐胺）方面的活性远高于组氨酸脱羧（产生组胺）。应用复合乳液显著延缓了大口黑鲈鱼片贮藏期间腐胺、尸胺和组胺含量的增加。腐胺和尸胺的产生与假单胞菌、气单胞菌和希瓦氏菌等相关，它们可作为鱼类腐败的主要指标。复合乳液有效抑制了这些生物胺的生成。

图5 大口黑鲈鱼片的生物胺含量

5 气相色谱-离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）挥发性成分分析

GC-IMS谱图显示，随着贮藏时间延长，挥发性化合物的数量（红色斑点）增加。

指纹图谱分析表明，不同贮藏阶段挥发性化合物的谱图不同。CK组（特别是后期）含有更多具有甜味、焦糊味、脂肪味的化合物（如2-甲基丁酸乙酯、异戊酸异戊酯、2-甲基丁醛等）。CT组的化合物种类和含量均少于CK组。两组的主要挥发性化合物均为酯类和醛类，但CK组酯类（9 种）和醛类（6 种）数量更多，CT组酯类（9 种）最多，醛类仅4 种。

正交偏最小二乘判别分析确定了10 种变量投影重要性（variable important in projection，VIP）值＞1的化合物可作为区分CK和CT组的潜在标志物，包括2-呋喃甲醇乙酸酯、3-甲基-2-丁烯醛等。

CK组中产生鱼腥味的物质（如异戊酸异戊酯-M）含量显著高于CT组。

酯类是成熟肉制品的典型气味，对风味影响大。CK组的气味强度大于CT组。低水平的醛和酯可增加大口黑鲈的特殊香气，但超过一定水平则会带来令人不适的食品气味。

图6 大口黑鲈鱼片挥发性化合物的GC-IMS谱图（A）、指纹图谱（B）及VIP＞1（C）

6 16S rDNA全长测序分析

6.1 α-多样性分析

所有样本的物种覆盖率在0.910～0.991之间。CT组的Shannon指数显著低于CK组，而Simpson指数则相反。这表明应用乳液抑制了大口黑鲈鱼片中细菌的生长，降低了菌群复杂性和物种多样性，与菌落总数结果一致。

图7 大口黑鲈鱼片微生物群落的覆盖率（A）、Shannon指数（B）、Simpson指数（C）

6.2 物种组成

CK组贮藏前期优势菌为巨球菌属、魏斯氏菌属和链球菌属；中后期被革兰氏阴性菌气单胞菌属和柠檬酸杆菌属取代（贮藏后期相对丰度分别为50.51%和22.34%）。CT组贮藏期间优势菌为红球菌属（前、中、后期相对丰度分别为92.40%、93.54%和66.18%）；贮藏后期，乳球菌属发展为第二优势菌（26.16%）。

图8 大口黑鲈鱼片的（A）物种数量（A）、细菌门水平（B）、细菌属水平（C）组成

6.3 β-多样性分析

CT组与CK组的细菌群落存在显著差异但也有部分相似性。LEfSe分析表明CK组不同贮藏阶段有显著富集的细菌（如魏斯氏菌属、链球菌属、气单胞菌属、柠檬酸杆菌属），而CT组仅在中期和后期有显著富集的细菌（红球菌属、乳球菌属）。这与物种组成分析结果一致，进一步证实了乳液处理改变了腐败过程中的优势菌群。

图9 大口黑鲈鱼片细菌群落的主成分分析（A）、非度量多维分析（B）及LEfSe分析（C）

7 相关性分析

典型对应分析表明，希瓦氏菌属、布特维西氏菌属、气单胞菌属和柠檬酸杆菌属均与好氧菌落总数、TVB-N、腐胺和尸胺含量呈正相关。异戊酸异戊酯-M与气单胞菌属、柠檬酸杆菌属和布特维西氏菌属呈显著正相关。乳酸菌属与乙酸乙酯-D、鲁特氏菌属与γ-丁内酯等也存在强关联。异戊酸异戊酯-M、3-甲基戊酸、4-甲基-2-戊酮、4-甲基噻唑、2-甲基丁酸乙酯和2-丁醇-D可被标记为大口黑鲈鱼片贮藏期间的腐败化合物。在贮藏过程中，应用乳液降低了气单胞菌属和柠檬酸杆菌属的相对丰度，并减少了异戊酸异戊酯-M和2-甲基丁醛-M的产生。

图10 大口黑鲈鱼片中细菌菌群与环境因子的典型对应分析（A）及相关性分析（B）

Conclusion

选用含4%大豆分离蛋白和25%豆油的复合乳液对大口黑鲈鱼片进行涂膜处理。该处理能有效延缓鱼片在10 ℃贮藏期间挥发性盐基氮含量、好氧菌落总数、腐胺、尸胺和组胺含量的上升，使其货架期延长至16 d。对于对照组，贮藏前期的优势菌为巨球菌属、魏斯氏菌属和链球菌属；在贮藏中后期，优势菌被气单胞菌属和柠檬酸杆菌属所取代。对于复合乳液处理组，红球菌属是整个贮藏期间的优势菌；在贮藏后期，乳球菌属发展为第二优势菌。在贮藏过程中，应用复合乳液降低了气单胞菌属和柠檬酸杆菌属的相对丰度，并减少了异戊酸异戊酯-M的生成。因此，本研究证实，壳聚糖-百里香酚复合涂膜有效延缓了大口黑鲈鱼片在贮藏期间的品质劣变，抑制了腐败菌的增殖，并减少了挥发性腐败化合物的形成。这表明壳聚糖-百里香酚复合涂膜在大口黑鲈保鲜方面具有潜在应用价值，并为提升水产品低温物流运输技术提供了参考。

Abstract

A composite emulsion was created by incorporating 4% (m/m) soybean protein isolate and 25% (m/m) soybean oil into a mixture containing 0.5% (m/m) chitosan and 1% (m/m) thymol. By comparing changes in total volatile basic nitrogen content, aerobic bacteria count, pH, biogenic amines content, volatile components, and microbial species in fish meat after storage at different times, the study explored the impact of composite emulsions on the quality of largemouth bass fillets during storage. Our results show that this composite emulsion effectively delayed the increase in total volatile basic nitrogen content, aerobic bacterial count, putrescine, cadaverine, and histamine contents of largemouth bass fillets during storage at 10 ℃, extending the shelf life to 16 days. The primary spoilage compounds observed during the storage of largemouth bass fillets were isopentyl butyrate-M, 3-methylpentanoic acid, 4-methyl-2-pentanone, 4-methylthiazole, ethyl 2-methylbutyrate, and 2-butanol-D. Furthermore, the addition of the emulsion during storage effectively reduced the relative abundance of Aeromonas and Citrobacter, while also decreasing the generation of isoamyl butyrate-M and 2-methylbutyraldehyde-M. In conclusion, the combination of chitosan and thymol coating not only delayed the deterioration of largemouth bass fillet quality during storage but also inhibited the growth of spoilage bacteria and reduced the production of volatile spoilage compounds. Therefore, this study can provide valuable reference for the preservation of largemouth bass and the application of low temperature logistics and transportation for aquatic products.

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