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该研究利用基于二代测序的目标区域捕获测序方法，在两个中国小眼球三代家系中分别对两个先证者进行了425个涉及常见遗传性非综合征眼病的基因的筛选。在家系1（缺损性小眼球）中发现了两个新的杂合突变， PXDN c.3165C>T (p.Pro1055Pro)和PXDN c.2640C>G (p.Arg880Arg)，在家系2（单纯性小眼球）中发现了CRYBB2 c.481G>A (p.Gly161Arg)，但在表型正常的未患病个体中均未发现突变。通过多重同源序列比对后证明其中CRYBB2 p.Gly161Arg突变是一种致病突变。该研究发现的三个新突变扩展了我们目前对小眼球遗传基础的认识，提供了早期诊断的可能，并强调了小眼球遗传诊断的重要性。

研究背景

小眼球是一种罕见的、遗传性或散发性先天性眼睛发育缺陷，其引起的儿童视力受损约占3-12%。小眼球以眼轴短(AL < 20.0-21.0 mm)，脉络膜和巩膜增厚，浅前房(ACD < 2.2 mm)和小角膜(水平角膜直径< 11 mm)为特点。根据解剖差异可将小眼球分为四种类型:单纯性小眼球,，伴有其它先天性眼缺损的小眼球，相对性眼前段小眼(RAM)和轴向高度远视。

目前，基因突变被认为是小眼球的主要致病原因。小眼球的主要遗传模式是常染色体显性遗传，但也有散发的患者。小眼球作为一种发育性眼病，涉及到的相关基因大部分也是眼发育相关基因，包括SOX2、OTX2、PAX6和GJA8。尽管已经证明有超过30个基因与眼睛发育有关，但目前仅能够在不到一半的患者中解释这些缺陷的遗传基础。此外，近年来对小眼球的研究主要依赖于临床观察，而对小眼球的相关新基因及突变的探索较少。因此，该研究探索了两个中国小眼球家系的新突变基因，并发现了3个新突变，为小眼球的预测、预防和分子治疗提供了新的可能。

研究结果

两个先证者的家系图见图1，其中四名小眼球患者的临床资料列于表1。

▲图1 先证者家系图

表1 四名小眼球患者的临床资料

▲图2 先证者的前节照和B超

▲图2a为先证者1（P5）的前节照(左)和B超(右)，黄色箭头显示严重的脉络膜缺损。图2b为先证者2（P4）的前节照(左)和B超(右)。

本研究利用基于二代测序的目标区域捕获测序方法，在家系1中发现了PXDN基因突变（图3，a. PXDN c.3165C>T (p.p pro1055pro)；b. PXDN c.2640C>G (p.Arg880Arg)）; 在家系2中则发现了CRYBB2基因突变（图4）。

▲图3 家系1中发现的PXDN基因突变

▲图4 家系2中发现的CRYBB2基因突变

接着，该文研究者进行了Sanger测序，验证家系1中的基因变异。结果表明先证者1的儿子P9也携带了PXDN基因相同的杂合突变(c.3165C>T和c.2640C>G)(图3和表2)。并且，这两个变异位于同一条染色体上。但是，在先证者的父母中并没有发现相同的等位基因和这两种突变。此外，质谱测序结果发现这两种突变并未导致氨基酸的变化。

表2 家系1和家系2中的突变

同样，本研究证明家系2中先证者的女儿(P7)也携带了CRYBB2基因的c.481G>A杂合突变(图4和表2)。然而，在先证者的父母中没有发现这种突变。进一步通过多重同源序列比对发现，CRYBB2及其后续序列在不同物种间均为高度保守的氨基酸序列(图5)，这提示该突变可能有致病作用。

▲图5 CRYBB2 p.Gly161Arg突变的多重同源序列比对分析

研究结论

本研究率先使用了专门为两个小眼球中国家系的确诊和早期诊断而设计的基于二代测序的检测方法。研究发现了3个可能导致小眼球的突变，PXDN c.3165C>T (p.Pro1055Pro)、PXDN c.2640C>G (p.Arg880Arg)和CRYBB2 c.481G>A (p.Gly161Arg)，它们可能是小眼球的致病原因。这些基因突变都是本研究新发现的，PXDN和CRYBB2基因的功能和相互作用有待进一步研究。本研究不仅对临床医师指导患者的治疗和预后有所帮助，还拓展了PXDN-和CRYBB2-相关小眼球的表型谱，增强了我们目前对小眼球遗传基础的认识。

Abstract

Genetic alterations are a major cause of microphthalmos, while novel-related genes and mutations in microphthalmos have rarely been explored. To identify the underlying genetic defect responsible for microphthalmos eyes in two three-generation Chinese families, we screened 425 genes involved in common inherited non-syndromic eye diseases with next-generation sequencing-based target capture sequencing of the two probands of two three-generation Chinese families diagnosed with microphthalmos. Variants were filtered and analyzed to identify possible disease-causing variants before Sanger sequencing validation. We enrolled two families with microphthalmos (Family 1: microphthalmos with congenital ocular coloboma and Family 2: simple microphthalmos). Two novel heterozygous mutations, Peroxidasin (PXDN) c.3165C>T (p.Pro1055Pro) and PXDN c.2640C>G (p.Arg880Arg), were found in Family 1, and Crystallin Beta B2 (CRYBB2) c.481G>A (p.Gly161Arg) was found in Family 2, but none of the mutations were found in the unaffected individuals, who were phenotypically normal. Multiple orthologous sequence alignment (MSA) revealed that the CRYBB2 p.Gly161Arg mutation was a deleterious effect mutation. In conclusion, the three novel mutations found in our study extend our current understanding of the genetic basis of microphthalmos and provide early pre-symptomatic diagnosis and emphasize the significance of genetic diagnosis of microphthalmos.

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科卢奕教授、郑天玉教授为该论文的通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金项目(no. 81670835)、国家自然科学基金项目(no. 81600719)、上海市科委项目(no. 11231200602)和上海市视觉损伤与重建重点实验室项目(no. 12DZ2260500)的资助。（撰文/唐雅婷、徐婕；校审 /卢奕)

通讯作者

卢奕，教授

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科研究院院长

郑天玉，副主任医师

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科医疗秘书

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