Science：肌肉也懂养生之道？

初稿 | 吴世林

校对 | 陈芳芳 胡敏

小编注 | 陈芳芳 胡敏 吴世林

排版 | 吴世林

编辑 | 孟美瑶

背景介绍

衰老肌肉干细胞（MuSC，muscle stem cell）最具代表性的表型特征之一，表现为细胞脱离静止状态重新进入细胞周期的速率减慢。这种减慢直接导致了衰老肌肉在损伤后再生速率的下降。事实上，对年轻和衰老的MuSCs进行的转录组学分析表明，细胞周期和增殖通路是随年龄增长而改变得最显著的通路之一。然而，衰老与MuSCs激活减慢之间的直接机制联系仍未完全阐明。

敲黑板啦！

1、衰老导致肌肉干细胞中NDRG1表达升高，抑制PI3K–AKT–mTOR信号，从而延缓MuSCs激活和肌肉再生；

2、在老年MuSCs中敲除NDRG1，可加快其从静息状态激活，并改善单次损伤后的肌肉再生；

3、NDRG1通过降低MuSCs的激活速度来增强其韧性和长期维持能力；

4、NDRG1high MuSCs在衰老肌肉中存活并富集，形成细胞幸存者偏差。

研究结果

1、肿瘤抑制因子NDRG1在衰老MuSCs中表达上调

为了鉴定可能导致MuSC激活速率随年龄增长而下降的遗传变化，研究人员分析了年轻和衰老小鼠MuSCs的转录组数据。RNA-seq数据的主成分分析（PCA）结果显示，年轻和衰老的MuSCs之间存在明显的分离，这表明存在与年龄相关的全局转录差异（图1A）。在生长因子信号转导和细胞周期相关基因中，N-myc下调基因1（Ndrg1，N-myc down-regulated gene 1）的表达随年龄变化最为显著，在衰老的MuSCs中，其表达量增加了3.5倍（图1B、1C和S1A）。NDRG1通过抑制多种生长因子信号通路，在多种细胞类型中发挥肿瘤抑制基因的作用。研究人员对后肢肌肉分离的肌纤维进行免疫荧光染色，以及对分离出的MuSCs进行蛋白质免疫印迹分析，证实了衰老的MuSCs中NDRG1蛋白的积累增加（图1D、S1B和S1C）（小编注：图1D表示年轻和年老小鼠的EDL单根肌纤维的代表性免疫荧光图像；图S1C表示年轻和年老小鼠Soleus单肌纤维的代表性免疫荧光图像。二者主要是为了在不同肌群（不同肌肉部位）来验证NDRG1表达上调的普遍性。其中CTCF的计算主要为了矫正总细胞荧光强度，专门用于消除背景噪音，准确衡量单个细胞内目标蛋白（如NDRG1）的实际荧光表达量。其计算方式如下：CTCF=目标细胞的整合密影度(总荧光)-(细胞面积×背景平均荧光强度)，其中整合密影度是指特定选区内所有像素灰度值/荧光强度的总和。）。

图1 | 衰老MuSCs中NDRG1的转录本和蛋白的丰度增加

图S1 | 小鼠MuSCs中NDRG1的表达量随年龄增长而增加

2、衰老小鼠MuSCs中敲除NDRG1基因，可导致MuSCs的激活增强和肌肉再生速率的提高

研究人员推测，NDRG1表达量随年龄增长而增加，这或许可以解释衰老MuSCs进入细胞周期的速率为何降低。为了验证这一点，研究人员构建了可在MuSCs中特异性敲除NDRG1的条件性敲除小鼠（Pax7PCER/+; NDRG1fl/fl; ROSACVFP/+，简称NDRG1cKO小鼠），以便在注射他莫昔芬（TMX）后敲除NDRG1（图S2A）。研究人员通过对分离出的MuSCs进行蛋白质免疫印迹分析以及对分离出的肌纤维进行免疫荧光染色，来证实NDRG1的缺失（图2A和2B）。为了探究NDRG1在衰老过程中的功能，将NDRG1cKO小鼠饲养至约20月龄，经TMX注射治疗两周后，分别从WT和NDRG1cKO小鼠的后肢肌肉中分离出MuSCs（图2C）。与对照组相比，衰老NDRG1cKO小鼠的MuSCs在激活期间进入S期的速率和线粒体积累的量显著增加，达到了与年轻MuSCs相当的水平（图2D和2E）。为了评估在体内NDRG1缺失促进MuSC激活中的作用，研究人员在约20月龄的NDRG1cKO和WT小鼠肌肉损伤后注射了EdU。3天后，分离出了活化的MuSCs（图2F）。与离体实验结果一致，研究人员发现来自衰老NDRG1cKO小鼠的MuSCs表现出更高的体内活化速率，其程度与年轻MuSCs相当（图2G）（小编注：在图2G中，是有呈现年轻对照的结果的。这是一种“基线标注法”，也就是在图2G柱状图上方有一条虚线Y，其对应的数据正是Young的统计结果。其他的数据可以直接对比看是否恢复到年轻小鼠的水平，且这样的作图方式更为简洁。）。

随后，研究人员研究了衰老肌肉特有的再生速率减慢是否可能由衰老MuSCs中NDRG1表达量的增加所驱动。研究人员首先使衰老的WT和NDRG1cKO小鼠的双侧胫骨前肌发生了损伤，并在7天后测量其再生程度（图2F）。结果显示，NDRG1cKO小鼠的肌肉再生速率有所增加（图2H和S2B）（小编注：正常成熟肌纤维细胞核偏周边，而损伤后新生/再生肌纤维常出现中央核。此项研究中，肌肉再生速率的增加并不是通过中心成核肌纤维的百分比来定量的，而是锁定中心成核肌纤维并通过其横截面积作为定量与对比指标。研究人员在损伤后第7天取小鼠胫骨前肌切片，利用Myotally软件分析整张肌肉切片中的所有中心成核肌纤维。计算这些新生肌纤维的平均横截面积来衡量再生程度。图2H展示了老年NDRG1cKO小鼠的中心成核肌纤维平均CSA显著高于老年WT小鼠。CSA面积越大，说明单根新生肌纤维生长得越粗壮、成熟度越高，因此再生速率越快。图S2B展示了中心成核肌纤维大小的整体分布，老年cKO小鼠的曲线峰值右移，证明cKO组的大尺寸肌纤维多，中心成核肌纤维整体尺寸分布均偏向更大面积，这从群体水平上确证了cKO组的肌纤维整体再生能力更强。）。相比之下，年轻的NDRG1cKO小鼠的肌肉再生情况与同龄对照组相比没有发现显著变化（图S2C和S2D）。因此，衰老MuSCs中NDRG1表达的升高介导了衰老肌肉中MuSCs激活速率减慢，并介导了衰老肌肉中肌肉再生能力的下降。

图2 | 衰老MuSCs中NDRG1敲除后，MuSCs激活增强且肌肉再生改善

图S2 | MuSCs中NDRG1的敲除增强了老年小鼠的肌肉再生能力

3、在衰老的MuSCs中敲除NDRG1会导致细胞存活能力受损，并在连续损伤后出现再生缺陷

衰老MuSCs的另一表型特征是细胞存活和恢复能力受损（小编注：衰老MuSCs在细胞存活和恢复能力上的受损，表型上表现为激活过程中凋亡率显著升高、对基因毒性应激的耐受性下降，以及在体内移植或重复损伤后细胞数量迅速减少，最终导致再生潜能进行性耗竭和肌肉修复失败。其分子基础涉及多个层面的协同紊乱：在代谢层面，衰老MuSCs中谷胱甘肽（GSH）耗竭且呈双峰分布，GSH低表达亚群因NF-κB过度激活而抑制NRF2驱动的抗氧化基因转录，无法有效清除活性氧，从而加剧氧化性DNA损伤和细胞死亡；在表观遗传层面，由于亚精胺合成过度消耗甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM），导致H3K9me2/me3和HP1α等异染色质标志丢失，染色质开放度增加和转座子去抑制，进而诱发基因组不稳定和DNA损伤累积，进一步削弱了细胞在激活过程中的生存能力；同时，衰老微环境中Notch配体表达不足使Hey转录因子下调，解除对Mdm2启动子的抑制，导致p53降解加速，使带有DNA损伤的MuSCs无法启动p53介导的检查点，从而在分裂时发生有丝分裂灾难。这些机制共同构成一个恶性循环，使衰老MuSCs的再生功能恢复力因存活与增殖间的内在冲突而严重受损。参考文献：[1] Benjamin, et al. Cell Metabolism, 2023; [2] Liu, et al. Cell Stem Cell, 2018; [3] Kang, et al. Nature Metabolism, 2024.）。鉴于衰老NDRG1cKO小鼠的MuSCs在激活速率方面表现出“返老还童”的现象，研究人员接着检测了NDRG1缺失是否会影响衰老MuSCs的存活率，结果发现，与对照组相比，其存活能力确实有所下降（图3A）（小编注：论文中检测死细胞的标准方法是流式细胞术结合Annexin V和PI双染色，Annexin V可以结合凋亡早期细胞外翻的磷脂酰丝氨酸，标记凋亡细胞。PI是一种不能透过活细胞膜、但能穿透死细胞或晚期凋亡细胞膜的DNA染料。只有同时被Annexin V和PI染色的细胞才被计为死细胞。在细胞层面，主要通过细胞表面标记物和增殖标记物来区分静息态和激活态。论文中选用CALCR（降钙素受体）作为静息态MuSCs的特异性标记物，PAX7是MuSCs身份标志物，因此CALCR⁺/PAX7⁺的细胞被认定为静息态干细胞。论文中使用EdU掺入实验来标记正在进行DNA复制（S期）的激活态干细胞，此外，MYOD是肌源性分化决定因子，是肌肉干细胞激活并启动生肌程序的关键转录因子；Ki67则标记所有处于细胞周期活跃状态（非G0期）的细胞，因此MYOD和Ki67的表达也可作为细胞进入激活和增殖状态的标志。NDRG1 cKO的表型是衰老MuSCs激活和再生加速，但也让细胞更容易死亡。图3A揭示了无论是直接进行死细胞染色检测还是培养40h（让细胞处于从静息态被激活、准备进入细胞周期的阶段）检测死细胞比例。缺乏NDRG1保护的细胞本身就变得更加脆弱，且同样无法有效抵御细胞周期重启带来的代谢压力。因此，与正常衰老的WT相比，NDRG1 cKO的存活能力显著受损，死细胞比例明显更高。）。同样，研究人员在使用CalcR染色后发现，衰老NDRG1cKO小鼠在肌肉损伤后21天，其静息状态的MuSCs的数量减少（图3B和S3A）（小编注： PAX7是肌肉干细胞身份标志物，PAX7始终在细胞核中稳定存在，其表达不随细胞状态变化而变化。图3B用PAX7⁺标记总的MuSCs，结果显示衰老NDRG1cKO小鼠总的MuSCs数量显著降低。图S3A用CALCR⁺/PAX7⁺标记静息态MuSCs，结果显示衰老NDRG1cKO小鼠的静息态MuSCs占比与对照组无差异。说明在损伤后第21天，虽然cKO组的MuSCs总数变少了，但幸存下来的那部分MuSCs中，能够重新建立静息态（表达CALCR）的细胞比例与正常衰老的WT小鼠是差不多的。作者所说的衰老NDRG1cKO小鼠在肌肉损伤后21天，其静息状态的MuSCs的数量减少，是图3B的MuSCs总数量减少和S3A的静息态细胞比例不变共同基础下得到的结论。）。由于肌肉损伤后MuSCs存活受损可能会导致后续损伤时肌肉再生能力下降，研究人员又在衰老NDRG1cKO和WT小鼠的肌肉中诱导了两次连续性损伤（图3C）。组织学分析显示，虽然NDRG1cKO小鼠的MuSCs本身具有更强的再生潜能，但其在第二次损伤后也表现出肌肉再生障碍，这很可能是由可用于再生的MuSCs储备减少所致（图3D）。并且，研究人员还观察到，在NDRG1cKO小鼠的肌肉在第二次受损21天后，小鼠的静息状态MuSCs的数量进一步减少（图3E）。

因此，NDRG1可能介导了衰老MuSCs中一种关键的表型权衡。虽然NDRG1的表达削弱了MuSCs快速激活和有效再生肌肉的能力，但也同时促进了MuSCs的存活能力，这表明在激活速率与恢复能力之间存在权衡关系。为了验证NDRG1随年龄积累增长而增加是否是为了某种存活偏向（即该偏向更优先保障细胞的韧性而非细胞功能），研究人员首先在小鼠年轻时开始敲除MuSCs中的NDRG1，随后将这些小鼠饲养至18至20月龄（图3F）。事实上，与同龄WT对照相比，衰老的NDRG1cKO小鼠的MuSCs总数量减少（图3G、S3B和S3C）。并且，衰老NDRG1cKO小鼠的肌肉再生也表现出显著延迟，这很可能是由于存活下来的MuSCs数量减少所导致（图3H）。研究人员认为，尽管衰老过程中机体会筛选出恢复力更强的细胞，然而衰老MuSCs的整体恢复力仍不及年轻MuSCs。NDRG1虽能增强这种恢复力，但仍有其他多种因素共同作用，导致老年MuSCs的韧性始终无法达到年轻水平。

这种关于细胞衰老的幸存者偏差理论，让研究者思考了一个关键的进化问题：如果NDRG1的表达可以赋予细胞生存优势并在衰老过程中被自然选择所保留，那么，既然它在自然选择压力最强的青年时期不为机体提供益处，为什么NDRG1没有直接从基因库中被剔除呢？为了研究这个问题，研究人员将年轻小鼠MuSCs中的NDRG1基因进行敲除，并测量了单次损伤或连续损伤后的肌肉再生情况（图S3D）。尽管如前所述，敲除NDRG1对单次损伤后年轻肌肉的再生没有显著影响（图S2D），但这会伴随年轻小鼠的总MuSCs数量下降（图S3E和S3F）。在面对再次损伤时，研究人员观察到肌肉中的总MuSCs数量进一步减少，并且此时出现了再生能力障碍（图S3G和S3H）。研究人员认为，这些结果支持了一种权衡模型：年轻干细胞中维持的NDRG1的低水平表达，一方面能确保快速再生，另一方面也保留了基础水平的恢复能力，使其能够适应年轻动物的组织环境并维持存活；然而，在衰老组织更加恶劣的微环境中，这种抗逆性则不足以维持其生存。

为了验证“年轻MuSCs中NDRG1升高也会带来不利影响”这一假设，研究人员从年轻小鼠肌肉中分离出NDRG1表达量最高的那群MuSCs，并将其与来自同一小鼠的NDRG1表达量最低的MuSCs进行功能检测比较（图S4A和S4B）（小编注：这里作者首先通过FSC/SSC、去除双细胞及CD31⁻CD45⁻Sca1⁻VCAM⁺等一系列圈门分析，获得纯化的MuSCs。作者在流式分选时并没有直接使用NDRG1作为表面分选marker，而是根据MuSC的FSC，也就是细胞大小，将两个极端大小的细胞群分选出来。随后在图S4B中进行验证，发现较小的MuSCs群体富集NDRG1High细胞，而较大的MuSCs群体富集NDRG1Low细胞。后续实验也表明，MuSCs激活伴随细胞体积增大，因此这一结果与NDRG1High MuSCs更偏静息、激活较慢的状态相吻合。）。与NDRG1低表达的MuSCs（NDRG1low）相比，年轻的NDRG1高表达MuSCs（NDRG1high）的激活速率降低（图S4C）。随后，研究人员对NDRG1high和NDRG1low MuSCs进行了移植，并通过生物发光成像监测细胞情况。移植NDRG1high MuSCs的肌肉中生物发光强度显著降低，这与激活速率减慢的表型相一致（图S4D）（小编注：作者这里用的不是EdU，利用的BLI（bioluminescence）生物发光。他们是从FVB-Tg(CAG-luc,-GFP) 转基因鼠中分选得到的MuSCs，该小鼠在CAG启动子驱动下表达firefly luciferase（萤火虫荧光素酶），研究人员移植之后在移植的小鼠体内注入荧光素酶的底物D-luciferin之后，注射后立即使用IVIS Lumina II活体成像系统（PerkinElmer）对小鼠进行成像。）。为了独立验证NDRG1在年轻MuSCs中表达上调的后果，研究人员对从年轻小鼠体内新鲜分离的MuSCs中过表达了NDRG1（图S4E）。结果发现，NDRG1的过表达导致激活速率降低（图S4F）。同样，移植了NDRG1过表达细胞的肌肉所显示的信号强度显著低于对照细胞（图S4G）。

尽管在对照条件下，研究人员未观察到NDRG1的过表达对MuSCs的存活率产生显著影响，但在氧化应激条件下，过表达NDRG1的MuSCs表现出更好的存活能力（图S4H和S4I）。因此，在年轻MuSCs中过表达NDRG1会减慢其激活速率，但与衰老的MuSCs一样，这伴随着抗逆能力的增强。

图3 | 敲除NDRG1的MuSCs在连续损伤后，衰老肌肉的细胞存活受损并出现再生能力缺陷

图S3 | NDRG1敲除减少了小鼠体内静息状态肌肉干细胞的储备量

图S4 | NDRG1表达升高延迟了肌肉干细胞的激活

4、在衰老MuSCs中NDRG1积累所导致的表型变化是通过抑制PI3K-AKT-mTOR通路来介导的

研究者试图确定NDRG1在衰老MuSCs中发挥作用的分子机制。为此，他们对来自衰老的WT和NDRG1cKO小鼠的MuSCs进行了RNA-seq分析。PCA结果显示WT和NDRG1cKO小鼠的MuSCs呈现出明显不同的聚类模式；火山图分析进一步发现，两组之间存在大量差异表达基因（图S5A和S5B）。基因集富集分析（GSEA）显示，在NDRG1缺失后，PI3K-AKT-mTOR通路中编码蛋白质的mRNA丰度有所增加（图4A和4B）。研究人员通过蛋白质免疫印迹实验证实，在NDRG1缺失后，该通路的激活程度有所增强（图4C-4E）。研究人员对RNA-seq数据进行分析显示，NDRG1缺失的MuSCs中，PI3K-Akt-mTOR通路中的多个基因（PIK3CA、AKT1、PTEN和CXCR4）表达上调（图S5C）。同时，NDRG1cKO小鼠的MuSCs中，mTOR通路下游靶点S6的磷酸化水平升高，而在使用mTOR抑制剂雷帕霉素处理后该磷酸化水平则降低（图S5D）。鉴于mTOR通路在促进细胞周期进程中的作用，研究人员验证了衰老NDRG1cKO小鼠MuSCs中细胞周期进入S期的加速是否由mTOR通路介导。使用雷帕霉素抑制mTOR后，NDRG1cKO小鼠的MuSCs进入S期的加速现象被显著抑制（图4F）。

静息状态的MuSCs中mTOR的激活会诱导一种被称为GAlert的预激活状态，其特征为激活过程加速，并可促进肌肉再生。基于NDRG1cKO小鼠MuSCs中mTOR信号传导增强的现象，研究人员测试了这些细胞是否也处于这种预激活状态。在GAlert状态下，MuSCs具有两个显著特征：更容易自发地结束静止状态，以及细胞体积增大。事实上，衰老的NDRG1cKO小鼠的MuSCs表现出了这些表型，而年轻的NDRG1 cKO小鼠的MuSCs则没有表现出这些表型（图4G-4I；图S5E和S5F）。这两种GAlert表型均在雷帕霉素处理后消失，这进一步凸显了NDRG1cKO小鼠MuSCs与GAlert状态的MuSCs之间的相似性（图4J-L）。同样，MuSCs中NDRG1的缺失并未导致任何可能继发性引起MuSCs激活的肌肉损伤迹象（图S5G-5K）（小编注：S5G-I，在衰老基因型小鼠中检测。S5G通过Laminin+DAPI染色，定量centrally nucleated fibers，正常成熟肌纤维细胞核偏周边，而损伤后新生/再生肌纤维常出现中央核，如图中箭头所示，因此该指标用于判断是否存在明显的自发性肌肉损伤/再生。S5H、I，分别定量MYOD⁺/PAX7⁺、Ki67⁺/PAX7⁺，用于判断是否存在因潜在肌肉损伤而继发的MuSCs激活及进入活跃细胞周期。图S5J-K是在年轻的基因型小鼠中验证，从年轻小鼠中分离出的MuSCs分别检测MYOD和Ki67显示，年轻小鼠中NDRG1缺失之后并不会让MuSCs在基线状态下进入明显的激活和细胞周期活跃状态）。

处于GAlert状态的MuSCs表现出一种mTOR依赖性的存活能力和长期维持能力缺陷，这与NDRG1cKO小鼠的MuSCs的情况类似。用雷帕霉素处理衰老NDRG1cKO小鼠，可部分挽救因NDRG1缺失而导致的存活能力受损（图4M）。此外，雷帕霉素处理抑制了NDRG1缺失MuSCs所特有的S期进入速率增强和线粒体积累增加（图S6A和S6B）。雷帕霉素处理还挽救了NDRG1cKO小鼠在连续损伤后出现的再生功能障碍（图S6C和S6D）。因此，随着年龄的增长，NDRG1的积累会抑制MuSCs中的mTOR信号传导，使这些细胞不易被激活，但更具有韧性。这些状况与GAlert状态形成鲜明对比——在GAlert状态下，MuSCs的mTOR信号通路传导增强，因而更容易被激活，但其韧性却有所降低。

拓展阅读 MuSCs的GAlert状态 MuSCs的静息状态并不是单一的，存在G0和GAlert两个阶段，共同构成一个静息周期。GAlert MuSCs仍大多数不处于细胞周期，但相比普通G0 MuSCs，更容易进入细胞周期。GAlert是一种“预激活/战备”状态，相比G0，GAlert MuSCs具备细胞稍大、转录活性升高、线粒体活性高，对后续损伤反应更快等特点，使MuSCs在不真正进入增殖的情况下提前做好代谢和细胞周期准备。其中mTORC1是G0→GAlert转换的核心调节器，并且GAlert是可逆的。损伤信号消失以后，mTORC1下降，MuSCs可以重新回到类似G0的状态。

虽然GAlert/mTORC1让再生更快，但不能长期维持，短暂激活mTORC1对组织再生是有益的。损伤以后需要mTORC1快速升高，才能让干细胞快速退出静息、启动增殖。但是持续或者反复激活mTORC1会导致干细胞损失。因为有研究发现mTORC1不只是促进干细胞激活，它还会推动MuSCs往肌源性方向分化，从而导致干细胞流失。

参考文献： [1]Haller, Samantha, et al. Cell stem cell. 2017. [2] Rodgers, Joseph T., et al. Nature. 2014.

图4 | MuSCs中NDRG1表达升高通过抑制PI3K‑AKT‑mTOR通路所产生的表型后果评估

图S5 | 老年NDRG1cKO小鼠MuSCs的类早衰样表型与PI3K-Akt-mTOR通路激活相关，且非损伤应答所致

图S6 | NDRG1在衰老MuSCs中表达升高所导致的表型后果可被mTOR抑制所减弱

总结  

衰老的特征在于组织损伤后的修复能力和再生能力的下降。在骨骼肌中，这种能力的下降主要源于MuSCs功能受损，导致其无法有效促进肌肉再生。研究人员揭示了这种与衰老相关的功能障碍的一个原因——细胞幸存者偏差，它优先保证了干细胞的存续，却以牺牲其功能为代价。随着年龄增长，MuSCs上调了一种肿瘤抑制基因的表达水平——N-myc下调基因1（NDRG1）。该基因通过抑制哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，提高了这些细胞的长期存活能力，但代价是削弱了它们迅速激活并参与肌肉再生的能力。这种随年龄增长而出现的肌肉再生延迟，可能源于一种权衡，即倾向于优先保障干细胞的长期存活能力，而非即时的再生能力。

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