Cell Metabolism：扛住年迈 肌不可失（下）

初稿 | 吴世林

校对 | 陈芳芳 胡敏

小编注 | 陈芳芳 胡敏 吴世林

排版 | 吴世林

编辑 | 孟美瑶

4、DMH和DHA中MC4R阳性神经元是介导Mimecan作用所必需的

骨骼肌来源的Mimecan是如何调节BAT功能的？存在两种可能性：一种是骨骼肌来源的Mimecan直接刺激BAT功能，另一种是骨骼肌来源的Mimecan刺激下丘脑中的某些特定神经元，导致支配BAT的交感神经系统被激活。为了研究这些可能性，研究人员检测了在对照组和SM-Mim-OE小鼠中将支配iBAT左叶的交感神经在内的五条神经分支的手术去神经的效果（图4A和4B）（小编注：根据本文引用文献所说，肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）接受五条肋间神经支配，这些神经束作为完整的传出-传入通路，共同传递中枢神经系统对iBAT产热与代谢的调控信号。该神经束内包含交感节后纤维与感觉传入纤维：前者通过释放去甲肾上腺素作用于脂肪细胞，驱动UCP1介导的非震颤性产热；后者参与感知局部组织代谢状态，并将信号反馈至中枢。这些神经纤维进入iBAT后进一步分支，分别精细支配脂肪细胞实质与血管壁，从而协调产热效率、脂解、葡萄糖摄取及组织血流灌注，实现对能量消耗的协同调节。破坏BAT的交感神经支配会阻断或严重减弱其对所有产热刺激的反应。参考文献：Vaughan CH，et al.  Methods Enzymol）。两组小鼠的iBAT右叶均进行了假手术。在手术去神经化42天后，与同龄对照组小鼠相比，SM-Mim-OE小鼠去神经化的iBAT左叶中Adrb3和Ucp1基因表达的上调被完全消除，而SM-Mim-OE小鼠假手术右叶中Adrb3和Ucp1基因表达的上调现象仍然存在（图4C）。研究者还证实，手术切除神经后，iBAT左叶的Adrb3和Ucp1的mRNA表达水平显著降低，交感神经支配几乎完全消失（图S4A和S4B）。这些结果清楚地表明，Mimecan是通过交感神经系统激活BAT功能，而不是通过直接刺激BAT。接下来，研究者通过对神经元激活的标志物c-Fos进行免疫组织化学染色，试图鉴定出下丘脑中负责该过程的神经元。有趣的是，与对照组小鼠相比，SM-Mim-OE小鼠仅在DMH/DHA区域表现出c-Fos阳性细胞数量的显著增加，而在室旁核（PVN）、视交叉上核（SCN）、弓状核、下丘脑腹内侧区（VMH）和下丘脑外侧区（LH）中则未见此现象（图4D和S4C）。此外，研究者发现Mimecan能刺激DMH后部和DHA区域的MC4R阳性神经元（图4E）（小编注：这里作者利用的RNAscope多重荧光原位杂交技术的原理，该技术检测的是mRNA而非蛋白，其信号特征是点状（punctate dots），每个荧光点理论上代表一个或几个mRNA分子的杂交信号。RNAscope信号通常会环绕在细胞核周围呈点状分布，其定性层面是在每个DAPI圈定的细胞核周围，分别计数该细胞胞质区域内是否同时存在Mc4r探针信号点和c-fos探针信号点的聚集。因此可以通过空间位置（同一个细胞的核周区域内）来判断这两种mRNA信号是否共定位于同一个细胞，但是本文作者并没有展示DAPI染色的通道图，没有提到他们是怎么圈定细胞核周围区域；在定量层面，作者在legend中提到他们测定了19个月龄对照组和SM-Mim-OE雌性小鼠DMH/DHA区域内每1个Mc4r阳性细胞中c-fos/Mc4r双阳性细胞所占的比例，并且在文中作者也提到利用Manders共定位系数（Manders’colocalization coefficient），Manders系数是定量共定位分析中常用的统计量，是专门用来衡量两个荧光通道的信号在同一空间位置重叠的程度。），这与先前报道该区域MC4R阳性神经元与BAT功能之间联系的研究一致。这些结果表明，骨骼肌来源的Mimecan通过激活DMH后部和DHA中的MC4R阳性神经元来激活BAT的功能，从而增强了作用于BAT的交感神经系统活动。因此，为了探究DMH/DHA区域中MC4R阳性神经元的功能是否对介导骨骼肌来源的Mimecan的作用必不可少，研究者对DMH/DHA区域进行脑立体定位注射表达Mc4r shRNA的慢病毒，以实现SM-Mim-OE小鼠的DMH/DHA特异性Mc4r敲低（图4F）。与注射表达scramble shRNA慢病毒的对照组小鼠相比，该区域的Mc4r基因表达降低了约50%（图S4D-S4F）。值得注意的是，与注射表达scramble shRNA慢病毒的对照组小鼠相比，在DMH/DHA区域注射Mc4r shRNA慢病毒的SM-Mim-OE小鼠中，核心体温调节功能的显著改善被完全消除了（图4G）。在DMH/DHA Mc4r敲低（KD）的SM-Mim-OE小鼠中，最大体温的升高幅度、最高与最低体温的差值的增加以及体温升高的斜率均有所减弱（图4H-4J）。此外，虽然从DMH/DHA scramble-KD的SM-Mim-OE小鼠体内分离出的iBAT在氧化磷酸化通路和最大刺激下反应方面均表现出线粒体功能的增强，但从DMH/DHA Mc4r-KD的SM-Mim-OE小鼠中分离出的iBAT与对照组小鼠相比却未表现出任何线粒体功能的增强（图4K）。在DMH/DHA Mc4r-KD SM-Mim-OE小鼠中，iBAT中Adrb3和Ucp1表达的上调程度也减弱了（图4L）。脂肪质量的变化与这些结果一致（图S4F）。综上所述，这些结果强烈表明，DMH/DHA中的MC4R表达是介导骨骼肌来源的Mimecan在衰老过程中维持BAT功能和核心体温调节作用所必需的。

图4 | DMH/DHA区域中的MC4R阳性神经元对于介导Mimecan的作用是必不可少的

图S4 | SM-Mim-OE小鼠DMH/DHA区域的c-Fos激活，以及SM-Mim-OE小鼠中区域特异性的Mc4r基因敲低

5、骨骼肌来源的Mimecan能够恢复老年小鼠DMH/DHA中MC4R阳性神经元中初级纤毛的年轻状态

那么，骨骼肌来源的Mimecan究竟是如何作用于MC4R阳性神经元的呢？首先，研究者推测Mimecan可能直接激活下丘脑神经元中的MC4R信号传导。虽然α-黑素细胞刺激素（α-MSH，MC4R的内源性配体）可以显著增加下丘脑GT1-7细胞内的cAMP水平，但是研究者发现，重组Mimecan蛋白在三种不同剂量下均无法提高其水平，这表明Mimecan通过一种不同的机制影响MC4R阳性神经元的活性（图S5A）。研究表明，MC4R选择性地表达于DMH和PVH的神经元初级纤毛上，且DMH中这些纤毛的长度会随年龄增长而缩短，从而导致老年大鼠棕色脂肪组织（BAT）功能受损。因此，研究者决定研究骨骼肌来源的Mimecan是否能够防止小鼠中由衰老引起的DMH/DHA MC4R阳性神经元初级纤毛的变短（图S5B）。事实上，通过腺苷酸环化酶3（ADCY3）进行免疫染色评估，23月龄小鼠的DMH/DHA区域中，MC4R阳性神经元的初级纤毛长度显著短于4月龄的小鼠（图5A和5B）（小编注：因为作者这里对于ADCY3和MC4R用的是两种不同的染色技术，Mc4r是用RNAscope原位杂交技术，如上所述检测是mRNA，所以Mc4r是以点状信号围绕在DAPI信号周围，不与DAPI重叠，也不会延伸到初级纤毛上。而ADCY3则是用免疫组化抗体检测的蛋白质，它几乎专一性地富集在初级纤毛的纤毛膜（ciliary membrane）上。初级纤毛是从细胞体伸出的一根细长突起结构，长度约2-10微米，直径约0.2微米，从细胞体基部的基体（basal body）发出，向外延伸。因此ADCY3的信号在荧光图像中呈现为从细胞体伸出的细长线状或棒状结构，与DAPI标记的细胞核在空间上是分离的，位于细胞体外侧。所以在这里ADCY3和MC4R并没有merge在一起。并且图5中检测Mc4r mRNA是为了定位哪些细胞表达Mc4r--鉴定MC4R阳性神经元的身份，而检测ADCY3蛋白是为了可视化和测量这些细胞的初级纤毛长度。两者在这张图里承担的是完全不同的任务，一个是细胞身份标记，一个是纤毛结构标记。三者的位置关系：最中心是DAPI（蓝色），紧贴核外是Mc4r mRNA点状信号（青色点）：散布在细胞核周围的胞质环形区域内，证明这个细胞是MC4R阳性神经元。从细胞体外侧伸出的是ADCY3线状信号（橙色）：一根或数根细长突起，基部起自细胞体，向外延伸，代表初级纤毛，其长度就是本文测量的核心参数。）。值得注意的是，研究者发现老年SM-Mim-OE小鼠中，DMH/DHA区域中MC4R阳性神经元的初级纤毛长度恢复到了与年轻小鼠相似的状态（图5C和5D）。为了研究骨骼肌来源Mimecan的效果是否依赖于初级纤毛自身的功能，研究者通过在DMH/DHA区域立体定位注射表达Ift88 shRNA的慢病毒，在SM-Mim-OE小鼠下丘脑中特异性敲低鞭毛内转运蛋白88（intraflagellar transport protein 88，Ift88，该蛋白编码纤毛蛋白转运的关键组分）（图5E）。与注射scramble shRNA慢病毒的对照组小鼠相比，该区域的Ift88基因表达降低了约50%（图S5C和S5D）。与注射scramble shRNA慢病毒的对照组小鼠相比，在DMH/DHA区域注射Ift88 shRNA慢病毒的SM-Mim-OE小鼠，其初级纤毛长度的显著增加被完全消除（图S5E和S5F）。与初级纤毛的这些变化一致，在DMH/DHA区域注射Ift88 shRNA慢病毒的SM-Mim-OE小鼠中，核心体温调节功能的显著改善也完全被消除了（图5F）。在DMH/DHA Ift88-KD的SM-Mim-OE小鼠中，最大体温的增加、最高与最低体温的差值以及体温上升的斜率均有所减弱（图5G-5I）。这些发现表明，骨骼肌来源的Mimecan在正向调节DMH/DHA中MC4R阳性神经元初级纤毛长度方面发挥着重要作用，使它们能够维持神经元活性，从而在衰老过程中维持核心体温调节。

图5 | Mimecan可恢复老年小鼠DMH/DHA区域中MC4R阳性神经元初级纤毛的长度

图S5 | Mimecan 对 MC4R 阳性神经元中初级纤毛及其下游信号通路的影响

6、将小鼠血浆中Mimecan水平恢复至年轻水平可显著延长其寿命

由于老年SM-Mim-OE小鼠恢复了强有力的昼夜体温调节能力，研究者推测小鼠的体温调节与寿命之间存在某种关联（图6A）。有趣的是，研究者发现25月龄时小鼠的最高体温与小鼠个体寿命之间存在明确的正相关关系（图6B,R2=0.5475）。最高体温与最低体温之间的差值与寿命之间也存在显著的正相关关系，尽管这种相关性稍弱一些（图6C,R2=0.2881）。这些结果表明，核心体温可能是小鼠寿命的一个重要预测指标。如果是这样的话，研究者推测SM-Mim-OE小鼠的寿命会比对照组小鼠更长。因此，研究者决定测量SM-Mim-OE和对照组小鼠的寿命（图6D）。令人震惊的是，与对照组小鼠相比，SM-Mim-OE小鼠的中位寿命延长了约7%（图6E）。与对照组小鼠相比，它们还表现出与年龄相关死亡率的显著降低（图6F）（小编注：根据文中Methods所说，研究者通过每日监测两组各40只小鼠的死亡情况，对老龄小鼠从19月龄开始划分若干个时间区间。针对每组的生存数据，研究者依次计算每个区间的年龄相关死亡率（qx，区间内死亡数/区间起始存活数），并根据hz = 2qx/ (2-qx) 公式，将qx转换为风险率（hz），从而将离散的死亡事件转化为连续变化的衰老风险值。在此基础上，研究者以年龄为横坐标、ln(hz)为纵坐标，对两组数据分别绘制了散点图并将其拟合成回归直线（图6F）。结果表示，SM-Mim-OE组随年龄增长的各区间风险值显著低于对照组。因此得出结论，骨骼肌过表达Mimecan显著降低了群体死亡率随年龄的指数增长速率，从群体层面延缓了生理性衰老进程），以及平均寿命和最大寿命的显著延长（图6G和6H；前10%最长寿小鼠：927.8±5.9天vs 981.0±9.7天；前20%最长寿小鼠：915.3±6.1天vs 968.1±7.5天）。尽管肿瘤是B6小鼠的主要死因，但在对照组和SM-Mim-OE小鼠之间，肿瘤的类型及其发生率并没有差异（图6I）。

图6 | 将小鼠血浆Mimecan水平恢复至年轻水平可显著延长其寿命

图S6 | 20月龄对照组与运动组小鼠的补充分析

7、老年小鼠骨骼肌和血浆中的Mimecan蛋白水平可通过自主跑轮运动得以维持

鉴于恢复年轻状态的血浆Mimecan水平能够延长小鼠的寿命，研究者的目标是找到一种更具有生理规律的方法，来在衰老过程中维持或增加骨骼肌和血浆中的Mimecan水平。由于血浆中约有一半的Mimecan来自骨骼肌，研究者推测运动可能是实现这一目标的有效干预措施（参见图2A）。研究者将20月龄的小鼠分为两组：一组安置在普通单笼中（对照组），另一组安置在带有转轮的单笼中（运动组）（图7A）。经过8周的自愿转轮运动后，运动组小鼠的脂肪量减少了约42%，而瘦体重没有发生显著变化（图S6A和S6B）。尽管运动组内量的运动量（自愿转轮运动的次数）存在较大差异（图S6C），但与对照组小鼠相比，该组小鼠的TA肌肉NMJs处的TH信号强度最高增加了50%，这表明为期8周的自愿运动增强了老年小鼠交感神经对骨骼肌的支配（图7B和7C）。与对照组小鼠相比，NMJs处TH信号的增加伴随着TA肌肉中Adrb2和Mimecan蛋白水平的显著提高（图7D和7E）。有趣的是，在整个自愿运动期间，运动组小鼠能够维持血浆中Mimecan的水平，而对照组小鼠的血浆Mimecan水平则呈现持续下降趋势（图7F）。甚至在自愿运动结束1周后，与对照组小鼠相比，运动组小鼠仍表现出显著增强的昼夜体温调节能力，同时，并伴有最高体温、最高体温与最低体温差值以及体温上升斜率的显著增加（图7G-7J）。此外，与对照组小鼠相比，运动组小鼠的iBAT脂肪堆积较少，且Adrb3和其他产热基因的表达水平均有所提高（图S6D和S6E）。研究者注意到，在运动组中，TA肌肉中NMJs处的TH信号强度与Adrb2或Mimecan蛋白的表达之间存在正相关的趋势（图S6F和S6G）。最后，研究者评估了骨骼肌来源的Mimecan是否为运动驱动的核心体温调节改善所必需。为此，研究者将10月龄的小鼠分为四组：对照组（普通笼，无转轮）、对照运动组（笼内设转轮）、SM-Mim-KO组（普通笼，无转轮）以及SM-Mim-KO运动组（笼内设转轮）。值得注意的是，与对照组小鼠相比，在SM-Mim-KO小鼠中由运动驱动的核心体温调节改善现象被完全消除（图7K），且其最大体温的增加、最高与最低体温的差值以及体温上升的斜率均有所下降（图7L-7N）。综上所述，这些结果表明，运动作为一种有效的生理干预措施，在维持老年人群骨骼肌和血液循环中的Mimecan水平以及强有力的核心体温调节方面，具有令人感兴趣的转化潜力。

图7 | 自愿转轮运动可维持老年小鼠骨骼肌和血浆中的Mimecan蛋白水平，并增强核心体温的调节能力

总结  

器官间交流在哺乳动物的衰老和寿命调控中起着至关重要的作用。在本文中，研究者通过对年轻和衰老小鼠的骨骼肌转录组学对比，鉴定出了Mimecan。骨骼肌来源的Mimecan通过BAT调节核心体温，而这一功能在老年小鼠中受损。骨骼肌特异性的功能缺失和功能获得模型表明，Mimecan通过维持DMH和DHA中MC4R阳性神经元的初级纤毛，激活这些神经元，从而增强作用于BAT的交感神经张力。此外，特异性敲低DMH/DHA中的Mc4r基因，可完全消除过表达Mimecan对BAT功能的影响。最后，恢复老年小鼠血液循环中的Mimecan水平能够显著延长其寿命，这表明Mimecan在对抗衰老和促进长寿方面发挥着关键作用。综合来看，这项研究证明了下丘脑、骨骼肌和BAT之间的器官间交流在哺乳动物衰老和寿命的全身性调节中具有重要作用。

原文链接：https://www.cell.com/cell-metabolism/fulltext/S1550-4131(26)00141-5

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