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Nature：没电了？闪充已就位（上篇）

已有 224 次阅读 2026-9-21 22:03 |系统分类:科研笔记

Nature：没电了？闪充已就位（上篇）

初稿 | 丁祎楠

校对 | 高铭远小编注 | 高铭远生茂正石丽排版 | 丁祎楠编辑 | 孟美瑶

长久以来，线粒体一直被视作专一合成ATP的细胞器，但大量研究证实，线粒体不仅发挥促进ATP生成的功能，还通过与其他细胞器的直接或间接相互作用参与多种细胞过程。早在20世纪50年代，已有研究报道线粒体与内质网之间的结构关联。后续研究逐步揭示了这些细胞器接触位点的功能，包括线粒体—内质网接触位点介导磷脂交换、钙离子转运及局部氧化还原信号调控。除内质网外，线粒体还可与溶酶体、过氧化物酶体和脂滴形成接触；在酵母中，线粒体还可与液泡及核膜发生接触。

线粒体是高度动态的细胞器，其胞内定位可随细胞状态和局部能量需求发生变化。虽然关于线粒体与细胞核之间的远距离信号传递已得到广泛研究，但关于这两种细胞器之间直接接触的研究相对有限。例如，在缺氧状态下，线粒体会聚集在核周区域；而在黑色素瘤细胞中，线粒体也会在TRAIL诱导的凋亡过程中聚集在细胞核附近。这种线粒体的定位方式有助于提高核内高能耗过程的能量供应效率。最近的研究表明，在癌细胞中，线粒体与细胞核之间的膜相互作用有助于将存活信号从线粒体传递到细胞核。此外，在酵母中，磷脂酰胆碱水平可通过调节线粒体-细胞核接触位点蛋白（Contact nucleus mitochondria 1，Cnm1）丰度，影响Cnm1-Tom70介导的线粒体-核膜接触。另一项研究进一步表明，线粒体中Mitofusin-2（MFN2）富集的接触位点可促进丙酮酸脱氢酶复合体以非经典途径进入细胞核，为组蛋白乙酰化提供乙酰辅酶A。然而，在不发生膜融合的情况下，这些接触位点如何实现代谢物或蛋白质的跨膜转移仍不清楚。

核孔复合体是一种由约30种核孔蛋白组装形成的大型多蛋白复合体，介导RNA和蛋白质在细胞核与细胞质之间的选择性运输。在细胞质一侧，核孔复合体形成伸向细胞质的细丝结构；其中，RNA结合蛋白2（RAN binding protein 2，RANBP2）是该细胞质侧细丝的主要组成部分。RANBP2包含多个功能域，参与调控多种生物学过程，例如借助 SUMO E3 连接酶结构域、RBD 结构域参与细胞有丝分裂期间纺锤体组装与染色体分离，借助其C 端结构域调控蛋白质稳态。尽管既往研究已建立线粒体-核膜接触与核内代谢及组蛋白修饰之间的联系，但高能磷酸化合物如何跨越核膜屏障并被高效、定向地供给细胞核仍不清楚。

研究人员在此报告了在核孔复合物（Nuclear pore complex，NPC）区域存在此前未被描述的线粒体-细胞核接触位点。通过高分辨率显微镜观察、蛋白质组学分析、临近标记技术以及基于CRISPR技术构建的体外和体内遗传模型，研究人员发现线粒体与NPC之间的连接直接依赖于核孔复合体细胞质侧细丝蛋白RANBP2，以及线粒体外膜蛋白VDAC1。研究人员还发现这种相互作用对于维持核内能量代谢稳态至关重要，同时也对胚胎发育和心肌细胞至关重要。

基于上述背景，来自美国亚利桑那大学医学与心脏病学系及萨弗心脏中心的Hesham A. Sadek团队在Nature发表研究论文Mitochondria directly interact with the nuclear pore complex，该研究结合高分辨率成像、蛋白质组学筛选和遗传模型，揭示了RANBP2与线粒体外膜蛋白VDAC1介导的线粒体与NPC锚定连接及其维持核内能量状态和细胞分化的作用。

敲黑板啦！

1、线粒体通过RANBP2-VDAC1锚定连接直接对接核孔复合体。

2、破坏该连接会减少线粒体-核孔复合体接触，并降低核内ATP和磷酸肌酸水平。

3、核内能量不足会降低核蛋白磷酸化、降低染色质可及性并抑制细胞分化。

4、 RANBP2 C端结构域缺失会导致胚胎致死、心肌发育迟缓和神经元分化障碍。

1、线粒体定位于NPC

为探究线粒体与核膜之间的空间关系，研究人员在10T1/2细胞中分别标记了外核膜蛋白含核外膜标志蛋白SYNE3（Spectrin Repeat Containing Nuclear Envelope Family Member 3，Nesprin-3）及线粒体。共聚焦和超分辨率显微成像可见，在10T1/2细胞和心脏组织中均有部分线粒体锚定在外核膜（图1A、图1B，白色箭头所示）。通过透射电子显微镜（TEM）对心脏、脑和10T1/2细胞进行观察进一步证实了这种接触，并且精准观察到线粒体通过电子致密丝状结构连接于核孔复合体上（图1C）。在10T1/2细胞中，研究人员分别对核孔核心蛋白 NUP107（图 1D）、核孔纤丝骨架蛋白 RANBP2（图 1E）进行免疫荧光染色，同时用线粒体探针 MitoTracker 标记线粒体，同样可见部分线粒体与NPC标志信号紧密邻近。这些结果提示线粒体与NPC之间可能存在物理接触。

图1：线粒体与细胞核的相互作用

鉴于心肌细胞中也可见线粒体-NPC接触（图1B、图1C上部），研究人员进一步探究了在线粒体代谢发生显著重塑的出生后心脏成熟期，线粒体与NPC接触是否会发生变化。研究人员分析了从出生后第1天（P1）到成年期的心脏组织。电镜定量结果显示，NPC相关线粒体的数量及分布在整个发育过程中都保持稳定，仅在P7到P14之间接触频率轻度升高（图1F-I）。为明确线粒体与NPC接触是否为各组织普遍存在的保守特征，研究人员还比较了成年小鼠心脏、大脑、小肠三种器官细胞。结果发现该接触可在多种组织中检测到（图1J-L）：其中肠上皮的线粒体与NPC间距略大，心肌细胞和神经细胞的线粒体与NPC之间的贴合更加紧密（图1M）。这些数据证明了线粒体与NPC之间存在保守的物理接触。

2、线粒体与NPC结合

为进一步探究线粒体与NPC相互作用的分子基础，研究人员在纯化线粒体的蛋白质组学数据中检索了NPC相关蛋白。研究人员先将L929小鼠成纤维细胞自身的线粒体DNA敲除，再从 C57BL/6 小鼠体内提取出线粒体 DNA，转入到无 mtDNA 的 L929 细胞里，构建出线粒体胞质杂种细胞（小编注：这是线粒体胞质杂交细胞（Transmitochondrial cybrid），即先将L929小鼠成纤维细胞自身的线粒体DNA耗竭，形成p0细胞，再转入C57BL/6J小鼠来源的线粒体，使其重新获得线粒体DNA。最终细胞的核基因组和主要细胞背景仍来自L929，而线粒体基因组来自C57BL/6J），从该细胞中分离出纯化的线粒体，然后通过蓝色原位凝胶电泳（BN-PAGE）结合质谱分析来检测蛋白质复合体（小编注：常规变性电泳需添加强变性剂并进行高温处理，会解离线粒体蛋白复合物、破坏蛋白蛋白之间的天然相互作用，仅能鉴定出线粒体内的单个蛋白，无法获取蛋白复合体的组装信息，而蓝色原位凝胶电泳（BN-PAGE）属于非变性解离，在温和去垢剂和非变性条件下分离完整蛋白复合体，能够维持蛋白复合物天然构象与蛋白间结合状态，后续结合质谱鉴定复合体组成蛋白，因此既能鉴定出蛋白种类，也能获得蛋白处于游离状态、某一复合体或超复合体中的迁移信息。）。结果发现在所分析的纯化线粒体复合体中可检出多种NPC蛋白（图2A、图S1A和补充表1）。除核篮结构相关蛋白外，大多数NPC亚复合体的蛋白均能被检测到，其中胞质侧核孔丝蛋白丰度最高。

随后，研究人员分别敲除电子传递链复合体I、III或IV并重复上述实验：结果显示，敲除电子传递链复合体后NPC蛋白肽段数量整体减少，其中胞质侧核孔丝蛋白RANBP2的肽段减少最为明显（图S1B）。此外在敲除复合体 Ⅰ 或复合体 Ⅲ 的细胞中，该下调效应尤为显著，提示线粒体呼吸链完整性可能影响NPC组分与线粒体的关联。

图2：线粒体-细胞核相互作用的蛋白质组学分析

图S1 Blue-Native 平台的线粒体与孔隙蛋白组学分析

3、蛋白质组学证实线粒体与NPC结合

基于TEM结果，以及复合体I或复合体III缺失细胞的线粒体中无法检测到RANBP2这一结果，研究人员推测RANBP2的 C端结构域（CTD）可能介导了线粒体与NPC的对接。系统发育分析表明，RANBP2-CTD结构域是脊椎动物特有且高度保守的结构域，其中后续预测的结合残基位于高度保守区域，提示该结构域在进化过程中受到较强的进化选择约束（图S2A—E）。基于脊索动物RANBP2全长序列构建的系统树可还原物种经典亲缘关系，而基于RANBP2-CTD结构域构建的系统树则呈现低分化和广泛的多分支结构，说明CTD 结构域在脊椎动物漫长进化中极度高度保守，CTD的高度保守性也进一步支持其具有作为候选相互作用结构域的潜力。为检验该假设，研究人员构建了表达GST融合标签的RANBP2 CTD蛋白，并通过圆二色谱证实该蛋白可正确折叠形成天然空间构象（小编注：圆二色谱（CD）的检测原理为手性物质的圆二色效应，蛋白质由L-型氨基酸组成，其肽键、芳香族氨基酸侧链等基团在空间中呈手性排列。当圆偏振光通过蛋白质溶液时，手性分子对左旋和右旋光的吸收不同，产生吸收差值，该差值随波长变化的图谱即为圆二色谱，因此可通过蛋白对圆偏振光的不同吸收，判断其二级结构。α螺旋通常在208和222 nm附近出现负吸收峰，β折叠约在218 nm出现负峰，而随机线团的谱形不同。去除GST标签后的CTD在190-260 nm测量三次并经BeStSel分析后，显示出α螺旋和β折叠特征，说明其具有稳定、有序的二级结构)（图2B）。然后用纯化的心脏线粒体进行GST-CTD Pull-down实验得到一条特异性40-kDa大小的蛋白条带；经质谱鉴定发现，该组分富集线粒体外膜蛋白，同时还检出ATP合酶亚基和ATP转运载体等线粒体内膜蛋白（补充表2）。在GST-CTD组分中，VDAC1是最丰富的OMM蛋白，相较对照富集>1.5倍（补充表3）。值得注意的是，既往报道的RANBP2互作蛋白主要结合于CTD以外的结构域（图S2F）。

研究人员又采用 BioID 邻近标记蛋白质组学技术开展反向验证，将生物素连接酶BirA分别与线粒体外膜标记蛋白TOM20或CTD融合，构建可被多西环素诱导表达的稳转10T1/2细胞系，同时设置仅表达 BirA 酶的空白对照；诱导蛋白表达后向细胞内添加生物素进行标记（图S3A）。为验证构建体功能，研究人员通过MYC 标签检测目的蛋白表达，并利用链霉亲和素检测细胞整体生物素化修饰水平。结果显示，预期分子量处可见MYC阳性条带；各构建体呈现不同的生物素化模式，其中可检测到 BirA 自身生物素化条带（图S3B）。完成验证后，研究人员通过链霉亲和素磁珠沉淀富集所有被生物素标记的蛋白，并进行质谱分析（图S3C、补充表4）。与BirA对照相比，TOM20-BirA特异性标记到90种蛋白；这些蛋白分布于多种已知与线粒体接触的细胞器，其中一部分属于细胞核来源蛋白（图S3D、图S3E）。这 90 种蛋白里，16种仅定位于细胞核，包括核孔蛋白43（NUP43），由于TOM20锚定于OMM，这一结果提示线粒体与NPC具有空间邻近关系（图S3F）。CTD-BirA特异性标记了98种蛋白，其中24种定位于线粒体，VDAC1是这些蛋白中唯一仅定位于OMM的蛋白（补充表5）。值得注意的是，实验中仅检测到一种线粒体基因组编码蛋白，其余被标记的线粒体内膜及基质核编码蛋白可能因CTD-VDAC1复合体邻近线粒体TOM20蛋白导入复合体而被标记（小编注：这些线粒体内膜或基质蛋白先在胞质核糖体上合成，再通过TOM蛋白导入线粒体，随后被分选到内膜或基质。作者推测，位于RANBP2-CTD与VDAC1接触处的BirA恰好邻近TOM20导入通道，因此这些前体蛋白在导入途中进入BirA的邻近标记范围并被生物素化。而线粒体基因组编码的蛋白在线粒体内部合成，不需要通过TOM20进入线粒体，所以几乎没有被CTD-BirA捕获）。综上，GST Pull-down和BioID两种独立蛋白质组学策略均将VDAC1鉴定为RANBP2-CTD最可能的线粒体结合蛋白。

通过蛋白质组学筛选，研究人员发现VDAC1是与RANBP2-CTD相互作用的首要候选互作蛋白。随后，研究人员进一步分析了RANBP2与VDAC1之间可能存在的相互作用。研究人员在10T1/2细胞和小鼠心脏组织中分别对RANBP2和VDAC1进行免疫荧光共染后发现VDAC1与RANBP2信号在线粒体 - 细胞核接触位点共定位（图2C）。研究人员还使用RANBP2和VDAC1抗体在10T1/2细胞中进行邻近连接实验发现野生型细胞的核表面可检测到大量 RANBP2 与 VDAC1 互作阳性荧光信号（小编注：作者先用来自不同宿主的两种一抗分别识别RANBP2和VDAC1，再加入带有不同短DNA寡核苷酸的二抗探针（常称PLUS和MINUS探针）。只有两种靶蛋白在细胞内距离足够近（通常约40 nm以内）时，两条DNA探针才可被连接成环，随后再加入DNA聚合酶以这个环状DNA为模板，进行滚环扩增产生一条长链DNA，并由荧光探针识别扩增产物），而在RANBP2敲除细胞系中该信号几乎消失（图2D）。为了排除VDAC1在蛋白质组学实验中的出现是由于其丰度较高这一可能性，研究人员借助蛋白质组学方法定量检测了10T1/2细胞中两种最丰富的OMM蛋白VDAC1和VDAC3的水平（图2E）。结果显示VDAC3与VDAC1的丰度接近，但仅VDAC1 可被 CTD-BirA 生物素标记，该现象可由 VDAC1、VDAC3 氨基酸序列差异解释（图2F）。综上，这些结果表明VDAC1是RANBP2介导线粒体-NPC连接的特异性线粒体结合蛋白。

图S2 RANBP2的系统发育与互作组

图S3 BioID稳定细胞系的表征

4、CTD与VDAC1结合的分子基础

为探究CTD与VDAC1相互作用的分子基础，研究人员基于已知的RANBP2 CTD蛋白晶体结构（蛋白质数据库ID：4I9Y）和VDAC1蛋白晶体结构（PDB ID：6G6U）通过AlphaFold进行蛋白互作预测。预测结果显示，CTD与VDAC1胞质侧表面存在置信度较高的相互作用（预测局部距离差异检验评分>70%），并且研究人员进一步鉴定出RANBP2中的F2977-D2978和VDAC1中的E50-T51-T52是介导二者结合的关键氨基酸位点（图2G）。预测模型显示，CTD与VDAC1结合后会形成直径约10Å的通道，且该结构不阻碍VDAC1孔道，因而这一结构特征可能促进磷酸肌酸（直径6.8-8.2Å）和ATP等代谢物由线粒体直接运输至NPC （小编注：AlphaFold本身不会输出孔径参数。本文把预测的CTD-VDAC1复合体以分子表面形式在ChimeraX中可视化，在两者界面看到连续空腔，并测量空腔相对两侧的距离，图2G标出的数值的平均直径约10 Å；同时模型显示CTD没有堵住VDAC1本身的β桶孔道。文中所述pLDDT大于70只表示相应局部构象具有中等以上预测可信度，并不等于证明该空腔真实存在、持续开放或能让代谢物通过）（图2G）。上述结果证实CTD-VDAC1相互作用可介导线粒体来源的代谢物定向递送至NPC邻近区域，从而提高细胞核局部能量供应效率。

为验证上述关键氨基酸位点的功能，研究人员分别构建了两类定点突变体：VDAC1 ETT三联氨基酸突变为LII、CTD FD双氨基酸突变为AA，模型预测结果显示这些突变将改变CTD取向、减小CTD-VDAC1接触面面积并降低复合体稳定性，但不影响各单个蛋白的整体三维折叠（小编注：这些结论来自野生型与突变型AlphaFold模型的结构比较。突变模型中的CTD相对位置和朝向发生偏移，界面上相互接触的残基减少，因此推断结合界面受损，稳定性降低。后续共免疫沉淀显示ETT或FD突变均显著减少互作，也证明了这个推测。“单个蛋白整体折叠不受影响”则来自WT和突变的VDAC1、CTD模型的比对，二者主链整体轮廓近似，仅界面残基及相对装配改变）（图2H、图S4A-D）。

为进一步证实VDAC1 ETT和CTD FD残基是介导CTD-VDAC1相互作用的关键作用位点，研究人员在敲除VDAC1的人诱导多能干细胞中进行FLAG磁珠免疫沉淀，以避免内源性VDAC1产生背景信号。为确保两种蛋白按化学计量比表达，研究人员使用Thosea asigna病毒2A肽（Thosea asigna virus 2A peptide,T2A）双顺反子构建体，将野生型或突变型 VDAC1 与带 FLAG 标签的 CTD 串联共表达，结果显示野生型VDAC1可与CTD发生强相互作用，而ETT或FD任一突变均会使该相互作用显著减弱（图2I）。此外，氨基酸序列比对证实VDAC1 蛋白中ETT三联氨基酸序列在人和小鼠VDAC1中均保守，而VDAC3中不存在该保守序列（图2L），与蛋白质组学观察到的亚型特异性结合一致。综上，这些数据证明VDAC1 ETT和CTD FD残基对维持二者稳定结合具有关键作用。

拓展阅读：T2A肽介导的双顺反子共表达

T2A来源于Thosea asigna病毒，是一段约20个氨基酸的短肽，其核心功能是通过独特的核糖体跳跃机制，使单一mRNA转录本生成两种独立、等量的目的蛋白，区别于传统蛋白酶切。

常规真核生物mRNA为单顺反子结构，一条转录本仅能翻译出一种蛋白。而T2A双顺反子表达体系可将两个目的基因通过T2A肽编码序列串联，由同一个启动子驱动转录，形成一条完整的融合mRNA。在蛋白质翻译延伸过程中，核糖体通读上游基因序列，当翻译至T2A肽末端高度保守的甘氨酸-脯氨酸特征位点时，T2A肽会引发核糖体空间构象改变，特异性抑制该位点肽键的形成，使上游蛋白提前释放、翻译终止。同时核糖体并不会脱离mRNA模板，而是发生跳跃继续向后移动，从脯氨酸开始启动下游基因的翻译过程，最终生成两种完全独立、无融合结构的成熟蛋白。与分别使用两个质粒或两个启动子相比，这种设计显著减少转染量和转录差异，更适合比较野生型与突变型蛋白互作。

参考文献

[1] Szymczak AL et al. Nat Biotechnol. 2004 Apr 4;22(5):589-594.

图S4 VDAC1和CTD突变体

5、线粒体与NPC接触的体外功能

为进一步研究RANBP2在形成线粒体与NPC接触位点中的作用，研究人员利用CRISPR-Cas9技术构建了RANBP2敲除（RKO）的10T1/2细胞系。qPCR、蛋白质印迹和免疫荧光染色均证实了RANBP2的mRNA和蛋白表达水平显著降低；并且与ONM标志物SYNE3相比，RKO细胞核膜处的RANBP2信号完全消失（图3A）。

图3:体外删除RANBP2

研究人员采用“接触位点评分”（CSS）定量线粒体-细胞核连接；CSS定义为与MitoTracker直接接触的SYNE3斑点数，再连续除以细胞核膜上SYNE3总斑点数和线粒体总面积进行归一化校正。结果显示RKO细胞的CSS显著降低（图3B、图3C）。同时研究人员发现VDAC1-KO 10T1/2细胞的线粒体—核孔接触位点也同样显著降低（图S5A-C），进一步证实了RANBP2-VDAC1参与线粒体向NPC的锚定。

随后，研究人员探究这些接触是否会影响核内能量供给水平，研究人员使用靶向染色质的ATP 荧光共振能量转移探针（ATeam-H2AX）检测核内 ATP 含量，结果发现RKO细胞的核内ATP水平显著降低（图3D、图3E）（小编注：ATeam是一种基于荧光共振能量转移的ATP传感器，核心为可结合ATP的细菌F0F1-ATP合酶亚基，两端分别连接CFP供体和YFP受体荧光蛋白。在ATP 水平较低时，ATeam构象舒展，供体与受体荧光蛋白距离较远，无法发生荧光共振能量转移，主要输出 CFP 荧光信号，而当ATeam与ATP结合后，蛋白空间构象折叠收缩，供体和受体荧光基团间距缩短，荧光共振能量转移增强，因此FRET/CFP荧光比值可作为探针所处位置ATP水平的相对读数。本文把ATeam与H2AX融合，依靠组蛋白 H2AX 锚定至染色质，再比较野生型、RANBP2敲除的核内FRET/CFP比值）。为解释这一结果，研究人员建立了反应-扩散生物物理模型，用于预测NPC处ATP浓度随线粒体距离的变化情况。模型预测，当线粒体与核孔距离由50nm（已锚定）增至500nm（未锚定）时，局部ATP浓度下降约90%，表明线粒体邻近NPC可显著提高局部ATP供应效率（图3F、图3G）。

如前所述，ATP并非细胞核内唯一的高能分子。细胞还依赖高能磷酸基团转移系统维持局部能量稳态，其中PCr是最主要的能量转运分子之一，PCr由ATP和肌酸在线粒体中合成，可转运至耗能位点分解释放ATP，因此适合作为核内的能量转移和储存分子。研究人员在细胞培养生长的不同阶段（基线、24h和48h），通过免疫荧光、图像分割和荧光定量技术比较了核内及胞质PCr水平（图3H）。结果发现与野生型细胞相比，RKO细胞核内PCr水平在所有时间点均显著降低，而胞质PCr随时间不断积累，说明RANBP2 敲除后PCr向细胞核转运受阻（图3H、图3I）。

细胞核能量匮乏直接导致细胞生长速率减慢，结晶紫染色增殖实验证实这种能量不足与细胞生长减慢相关；碘化丙啶染色和荧光激活细胞分选（FACS）分析进一步发现RKO细胞G1 期向 S 期转换进程受阻，细胞周期停滞（图S5D、图S5E）。

此外，研究人员发现RKO细胞的核内PCr降低并非细胞周期改变所致（图3J、图3K）。为确认细胞核能够利用PCr再生ATP，研究人员在10T1/2细胞中检测到两类肌酸激酶亚型：线粒体定位的肌酸激酶1/2（Mitochondrial creatine kinase 1/2,CKMT1/2）和细胞核定位的肌酸激酶CKB（图3L），证实了PCr在线粒体生成并于细胞核内再生ATP的能量转运模型（小编注：肌酸激酶催化可逆反应ATP + Cr ⇌ PCr + ADP，CKMT1/2位于线粒体，CKB位于细胞核，说明线粒体和细胞核均能够利用PCr进行能量转运，在反应中肌酸激酶只负责催化双向反应，不能决定化学反应方向，反应方向由环境内ATP、ADP、肌酸、磷酸肌酸的浓度比决定。线粒体局部 ATP 富集，便驱动反应正向催化，消耗 ATP 合成磷酸肌酸；细胞核缺少产能线粒体，转录、复制持续消耗 ATP 造成 ADP 累积，则催化逆向反应，分解磷酸肌酸再生 ATP。同时结合前文作者发现破坏RANBP2–VDAC1介导的线粒体–核孔接触后，核内PCr和ATP显著下调，上述结果共同支持证线粒体磷酸肌酸细胞核的能量穿梭通路）。最后，研究人员在体外探究了VDAC1与RANBP2结合缺失所产生的功能影响，已有研究证实，表皮生长因子刺激或缺氧环境均可促进细胞线粒体向细胞核周聚集；但即使在上述刺激下RKO细胞的CSS仍显著偏低，表明RANBP2-VDAC1锚定连接参与线粒体向核周区域的募集过程（图S5F、图S5G）。