Science：线粒体“撸串”的学问（下篇）

初稿 | 丁祎楠 

校对 | 石丽小编注 | 高铭远 生茂正 石丽排版 | 丁祎楠编辑 | 孟美瑶

3、串珠形成过程会导致核样体解聚

在串珠形成过程中，核样体的强度分布变得更加清晰，其半峰全宽（FWHM）（图3A、图S9C）接近衍射极限（通过TFAM-RFP和SYBR Gold测量，分别为中位数377±61和404±81纳米）。典型核样体直径约为100至200 nm（图3B、图S9D），通过STED成像可以清晰分辨这些核样体，这表明每个核样体平均包含约1.6个DNA点（U2OS和HeLa细胞中分别为1.64±0.12和1.60±0.18），这与之前的估计（1.4至1.6）一致。研究员发现约40%的核样体包含多个DNA点（图3C）。因此，研究员假设串珠形成过程可能将多拷贝核样体分散为单拷贝核样体，从而解释了串珠化过程中核样体尺寸和核样体间距的下降（图3D）。

图3：串珠化能促进核样体解聚。

事实上，串珠化使得细胞核样体的数量相较于未串珠化的线粒体增加了10%至13%（在U2OS和HeLa细胞中分别为113±4和110±6%）。研究员捕捉到了伴随串珠化发生的分裂事件（图2J、图3E、图3F和影片S2），这导致一个更大、更明亮的核样体焦点分裂成两个更小、更暗淡且更呈球形的焦点。由于SYBR Gold荧光强度与DNA含量成正比，这些数据揭示了DNA在两个生成的核样体中几乎实现了等量的分离（图3G、图S9F）。此外，研究员还从冷冻保存的相关全细胞FIB-SEM和体积SIM成像中对核样体进行了分割和定量（图3H），并根据电子显微镜中线粒体的串珠化状态对它们进行分类。与其他测量结果一致，研究员发现83%的串珠体中含有核样体焦点，且串珠化线粒体内的核样体直径更小，整合的DNA强度也低于管状线粒体内的核样体（图3I、图S4C-E），这表明它们包含的mtDNA拷贝数更少。虽然线粒体DNA的复制是核质生长的基础，但研究员并未观察到在珠状线粒体中存在Twinkle阳性正在复制的核样体的聚集现象（图S9G-J）。研究员推测，这是因为mtDNA复制发生在小时级时间尺度，而串珠化发生在秒级时间尺度，两者在时间尺度上的差异使得二者不容易表现出直接关联。相反，串珠化是一个与核样体状态或细胞位置无关的组成性过程（图S1A）。根据每分钟5.5±4.5次事件的量化数据，研究员估计每29小时内（一个细胞周期，文中未给出统计方法），U2OS细胞会有9570次珠化事件，或约67000次珠化收缩。这远远超过了每次复制后需要分离的约1000个核样体的典型数量（图S7G、图S7H）。

4、串珠状结构的出现频率以及嵴的封闭情况决定了核样体的生理分散过程

研究员的模型预测，调节串珠化的形成时间或频率将会影响核样体的分散。离子霉素（Ionomycin）是一种钙离子载体，能够促使整个线粒体网络同步发生串珠化，通常在给药后15到30秒内完成（图4A）。研究员发现，使用离子霉素处理会降低单个细胞内mtDNA核样体之间的平均间距，并增加三维核样体间距分布的规则性（图4B），这支持了线粒体网络串珠化与核样体分布之间存在因果关系。

图4：串珠调制破坏mtDNA类核分布

作为另一种不同类型的扰动，有报道称抑制线粒体分裂（通常是通过移除其执行者 GTP酶DRP1来实现）会增加串珠化的频率和持续时间。研究员在一部分仍呈管状的线粒体中也观察到了这一现象（图4C）。然而，DRP1具有多种功能，其缺失也会导致网络中大片区域的膨胀，这些区域不会形成串珠，且核样体会在其中积累（线粒体泡）（图S10A）。为了在保持线粒体管状形态的同时调节串珠形成，研究员进行了一系列干扰实验：分别通过沉默线粒体特异性DRP1适配蛋白MFF或FIS1来抑制中部或外周分裂（图S10B-E）；通过沉默IMM蛋白ATAD3A和ATAD3B来抑制核样体连接和膜间耦合（图S10F）（小编注：沉默线粒体内膜蛋白 ATAD3A 与 ATAD3B可以特异性破坏线粒体核样体间的物理连接、解除线粒体内膜与外膜的膜间耦合，打破内外膜的协同形变与联动结构；该操作不直接抑制线粒体膜分裂过程，区别于 DRP1、MFF、FIS1 介导的经典分裂抑制，仅拆解了核样体连接与膜间耦合结构，且该结构的破坏不会改变线粒体串珠化频率、可维持核样体分散，证明核样体连接与 IMM-OMM 膜间耦合并非线粒体串珠结构形成及核样体分离的必要条件）；或者通过沉默MCU或INF2来抑制ERMCS功能。任何一种类型的分裂抑制都会导致串珠形成频率增加（图4C），并且线粒体延长且仍保持管状形态（图S10B、图S10E）。FIS1的敲低导致串珠化频率的增加幅度大于MFF的敲低，这可能是因为在缺乏FIS1的情况下，内质网膜结合蛋白复合体（ERMCS）得到了富集，或者质量控制机制遭到破坏，从而导致嵴结构发生紊乱。同时，ATAD3两种亚型的下调并未影响串珠化频率，且维持了核样体的分散。这表明核样体和IMM-OMM的连接对于串珠状结构形成和由此产生的核样体分离并非必需。抑制串珠化形成的siMCU细胞（串珠状结构形成频率降低约50%）呈现出异常增大和拉长的核样体（长度超过2μm），被命名为“巨型类核”（Nucleotes）（图4D、图4E），同时还有正常呈点状分布的核样体区域和无核样体的线性线粒体区域。Nucleotes通常在约1.5分钟的采集过程中保持稳定，且线粒体的变形并未将其分离。对MCU的免疫荧光标记证实，这一现象仅在沉默MCU后出现（图S5F）。在INF2基因沉默的细胞中，Nucleotes也大量存在，这与对照组或裂解抑制条件下的情况不同。研究者通过比较不同扰动条件下每个细胞中核样体长宽比的中位值，即长轴长度与短轴长度之比，对这一现象进行了定量（长轴/短轴长度；图4D）。

作为另一种阻断钙内流的手段，研究员使用了MCU抑制剂Ru360对细胞进行处理，这导致串珠化频率显著降低（图4F）。处理6小时或24小时均会导致细胞核样体伸长（图4G、图4H和图S11A），但对线粒体网络形态没有明显影响；在去除Ru360后，串珠缺失和核样体聚集问题均得以恢复。这些观察结果支持了钙调节的串珠形成在驱动核样体解聚方面的重要性。

MIC10缺陷型HeLa细胞（通过siRNA或稳定敲除）为研究层状嵴在核样体分布中的作用提供了实验体系。与对照细胞类似，研究员观察到核样体分裂和重新分布与线粒体串珠化同步发生（图4I、图S12A-C），并且每个持续的串珠结构通常包含一个核样体焦点（图S12A）。相比之下，缺乏MIC10的线粒体中出现了长达6μm的核样体，并且还有大量无核样体的线粒体片段（图4J、视频S3）。在静态图像中，研究员还观察到68±20%的细胞中有Nucleote，而对照组细胞中这一比例仅为14±11%，这同样反映在中值直径和核样体比例方面的变化上（图4K、图S12D）。鉴于在缺乏MIC10的情况下核样体出现率显著增加，这一结果出乎意料。通过STED成像技术，研究员发现Nucleote是由沿线粒体长度分布的多个核样体聚集而成（图4L、图S12E），通过核样体的聚集现象可以轻易地被串珠化分裂成较小的焦点（图4M）。然而，在缺乏层状嵴的线粒体中，被串珠化分开的Nucleote会迅速重新融合（图4M、图S12F），这强调了嵴结构完整性在通过空间位阻维持核样体间距方面的重要作用。为了评估不同扰动对核样体间距的影响，研究员开发了一个能够定量Nucleote的分析流程。该流程使用的是Otsu阈值法（一种自动图像分割方法，通过寻找一个最佳灰度阈值，把图像像素分成“前景”和“背景”，使两类之间的差异最大、类内差异最小）而非峰值检测（图S11B、图S11C）。这种核样体间距分析显示，增强串珠化并未进一步提高核样体间距的规则性（图4N），这与研究员从三维网络分布中得出的结论（图2C）相似，表明生理上的核间分布维持在通过可逆串珠化所能达到的精度极限附近。降低串珠化频率的干扰（siMCU和siINF2）显示，在串珠化缺陷细胞中核样体分布规则性持续丧失（图4N），同时核样体显著变长（图4D、图4E）。

为了进一步检验该模型，并明确钙内流与嵴完整性之间的关系，研究者使用 Ru360处理对照细胞和MIC10敲除HeLa细胞。研究者预测，抑制钙内流不仅会削弱MIC10敲除细胞中过度增强的串珠化，还会使联合扰动条件下的 Nucleote 表型进一步加重。实验结果确实显示，Ru360在两种细胞中均一致降低串珠化频率（图4O），支持钙内流触发串珠化的模型。此外，在联合处理条件下，核样体间距进一步缩小，而核样体延长进一步加重（图4P、图4Q、图S11D）。这与钙内流和层状嵴在维持核样体稳态中发挥协同作用的观点一致。

无法发生串珠化的情况，例如siMCU、siINF2或Ru360处理，或者无法限制核样体运动的情况，例如siMIC10或MIC10敲除，都会导致核样体聚集以及mtDNA分布异常（图4R）。综合来看，这些数据支持一个模型：核样体解聚和核样体间距建立在机制上由内质网-线粒体接触位点介导的钙触发性串珠化驱动；而层状嵴结构的完整性则提供对串珠化的抵抗和恢复能力，并维持已经建立的核样体分离状态。

图S10 线粒体分裂和核样体锚定相关因子对串珠化及核样体分布的影响

图S11 Ru360抑制钙内流导致串珠化减少和核样体异常聚集

图S12 MIC10缺陷促进Nucleotes形成并削弱核样体间距维持

总结

本研究发现了一种名为串珠化（Pearling）的可逆形态变化，即线粒体从管状转变为规则的“珠串”结构0.8 μm的特征间距驱动mtDNA核样体解聚和重新排列。机制上，串珠化由内质网-线粒体接触位点介导的Ca²⁺内流触发。通过抑制 MCU、INF2或使用Ru360会降低串珠化频率，并导致核样体异常延长和聚集，形成“巨型类核”（Nucleotes）。另一方面，MIC10缺陷导致层状嵴结构受损时，虽然串珠化增强，但被分离的核样体容易重新聚集，说明线粒体嵴结构对维持核样体间距具有关键作用。

综上，该研究提出串珠化是一种物理性、可逆且不依赖主动运输的mtDNA核样体分布机制，其中Ca²⁺信号负责触发串珠化，层状嵴结构负责维持核样体分离状态，为理解线粒体基因组空间组织和相关疾病机制提供了新视角。

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