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Cell Metabolism：你的脂肪，正在“绑架”你的大脑

已有 305 次阅读 2026-9-21 22:07 |系统分类:科研笔记

Cell Metabolism：你的脂肪，正在“绑架”你的大脑

初稿 | 丁祎楠

校对 | 生茂正小编注 | 高铭远排版 | 丁祎楠编辑 | 孟美瑶

肥胖以脂肪组织中过量脂质蓄积为主要特征，与代谢性疾病和心血管疾病风险升高以及预期寿命缩短密切相关。然而，尽管肥胖已成为全球重要公共卫生问题，其有效干预仍面临巨大挑战。因此，深入阐明机体能量稳态的调控机制，对于开发更有效的肥胖治疗策略具有重要意义。

越来越多的证据表明，中枢神经系统（Central nervous system, CNS）在全身能量稳态调节中发挥基础性作用。为了维持能量平衡，CNS需要持续感知并整合来自外周组织的多种代谢信号，从而精确协调食物摄入与能量消耗。一般而言，短期能量平衡主要依赖胃肠道来源信号以调控摄食行为，而长期能量平衡则更多依赖脂肪组织来源信号，以反映机体能量储存状态并调节整体代谢。

瘦素是由脂肪组织分泌的经典激素，也是反映机体能量储存状态的重要外周信号。作为中枢能量稳态调控的负反馈因子，瘦素主要通过作用于表达瘦素受体的特定中枢神经元群，抑制促摄食神经通路并激活厌食性神经环路，从而减少食物摄入并促进能量消耗。瘦素信号通路在包括小鼠和人类在内的哺乳动物中高度保守。然而，瘦素抵抗（其特征是对瘦素分子的中枢反应减弱）破坏了外周能量储存与CNS之间的通讯。这种脂肪组织与中枢之间通讯受损的现象，长期以来一直是抗肥胖药物治疗面临的主要障碍。尽管已有几种脑局部机制被提出用以解释瘦素抵抗，但其确切机制仍不清楚。

脂肪组织来源的细胞外囊泡作为脂肪组织与包括肝脏、骨骼肌和胰岛在内的其他器官之间通讯的重要介质，在维持全身代谢平衡或触发代谢紊乱方面发挥着至关重要的作用。然而，AT-EVs是否参与中枢瘦素敏感性的调节以及能量稳态的维持尚待阐明。

为了探寻这一问题，南京大学毕艳课题组团队开展了系统研究，相关成果以“Adipocyte-derived extracellular vesicles are key regulators of central leptin sensitivity and energy homeostasis”为题发表在《Cell Metabolism》上。在该研究中，作者证实脂肪细胞来源细胞外囊泡可通过递送特定miRNAs调节下丘脑瘦素反应性，其中 miR-148a-3p、miR-30a-3p等分子通过抑制瘦素信号负调控因子维持中枢瘦素敏感性；而在肥胖状态下，这类miRNAs的缺失则促成了中枢瘦素抵抗。进一步地，作者开发了由特定膜蛋白修饰的工程化外囊泡，实现了瘦素增敏miRNAs向中枢神经系统的靶向递送，为肥胖治疗提供了新的干预思路。

敲黑板啦！

1、脂肪细胞来源的细胞外囊泡（Ad-EVs）是调控中枢瘦素敏感性和能量平衡的关键调节因子

2、Ad-EVs中的miRNA货物形成一个调控中枢瘦素信号的网络

3、Ad-EVs中瘦素增敏miRNA的缺失促进中枢性瘦素抵抗的发生

4、通过工程化Ad-EVs将瘦素增敏miRNA靶向递送至中枢神经系统可缓解肥胖

1、AT-EVs调节能量平衡

为探究脂肪组织来源的细胞外囊泡（AT-EVs）是否参与机体能量稳态调控，研究者向Cas9转基因小鼠脂肪组织内注射携带Rab27向导 RNA（gRNA）的腺相关病毒（AAV），建立了脂肪组织特异性Rab27基因敲除（Rab27 KO）小鼠模型。Rab27是小囊泡分泌所必需的小GTP酶之一（图1A、S1A）。对照组小鼠注射了不含gRNA的AAV（Rab27 WT）。与Rab27 WT小鼠相比，Rab27 KO小鼠脂肪组织中的Rab27a和Rab27b mRNA水平显著降低，而肝脏、骨骼肌、心脏、肺、脾脏、肾脏和脑组织中未见显著变化（图S1B-E）。纳米颗粒分析和免疫印迹检测（CD63、CD9、Alix和TSG101）证实，与Rab27 WT小鼠相比，Rab27 KO小鼠的AT-EV产生显著减少，而脂肪因子基因表达（如瘦素、脂联素或成纤维细胞生长因子21[FGF21]）则保持不变（图S1F-I）。与Rab27 WT小鼠相比，在普通饲料（NCD）喂养条件下，Rab27 KO小鼠的体重和脂肪质量显著增加，而瘦体重质量无显著变化（图1B、1C）。葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐量试验（ITT）显示，与Rab27 WT小鼠相比，Rab27 KO小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性受损（图1D、图1E）。组织学检查显示，与Rab27 WT对照组相比，Rab27 KO小鼠的附睾白色脂肪组织（eWAT）和腹股沟白色脂肪组织（iWAT）中的脂肪细胞体积明显增大（图1F-H）。

图1：特异性抑制脂肪组织来源的细胞外囊泡（AT-EVs）导致能量平衡受损

图S1：特异性抑制脂肪组织来源的细胞外囊泡导致能量平衡受损（与图1相关）

值得注意的是，代谢笼分析显示，与Rab27 WT小鼠相比，Rab27 KO小鼠表现为食物摄入量增加，氧耗下降以及呼吸交换率（RER）升高，表明其脂肪作为能量来源的利用率降低（图1I-M）。然而，两组小鼠之间的体力活动无显著差异（图1N）。与观察到的氧气消耗量下降一致，Rab27 KO小鼠的体温和棕色脂肪组织（BAT）产热基因表达（包括解偶联蛋白1、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子1α和雌激素相关受体α）均显著降低（图1O、图1P）。同时，Rab27 KO小鼠BAT中交感神经活性标志物酪氨酸羟化酶（TH）的表达也显著降低（图1Q）。上述结果表明，抑制AT-EV分泌会破坏机体能量平衡。

为进一步判断能量失衡表型是否由AT-EV分泌受损所致，研究人员通过静脉注射方式给Rab27 KO小鼠输注从NCD喂养小鼠（chow-EVs）或肥胖高脂饮食（HFD）喂养小鼠（HFD-EVs）中提取的AT-EVs（图1R）。通过免疫印迹、透射电子显微镜（TEM）和NanoSight分析对AT-EVs进行评估（图S1J-L）。与对照Rab27 KO小鼠相比，chow-EV处理可显著降低体重和每日食物摄入量，增加能量消耗，降低RER，并减小脂肪细胞体积。相比之下，与对照Rab27 KO小鼠相比，HFD-EV处理的Rab27 KO小鼠在体重、脂肪质量、食物摄入量、氧气消耗量或RER方面均无显著差异（图1S-Z）。为严格评估肥胖AT-EVs的功能，研究人员将携带Rab27 gRNA的AAV注射到饮食诱导肥胖（DIO）Cas9转基因小鼠的脂肪组织中，构建Rab27 KO DIO小鼠模型，随后静脉注射chow-EVs或HFD-EVs。与对照Rab27 KO DIO小鼠相比，chow-EV处理的Rab27 KO DIO小鼠（而非HFD-EV处理的Rab27 KO DIO小鼠）表现出体重和每日食物摄入量降低、能量消耗增加、RER降低以及脂肪细胞体积减小。这些结果表明，健康的AT-EVs在维持能量稳态中发挥关键作用（图S1M-U）。

此外，为确定AT-EVs对肥胖的潜在影响，研究人员通过静脉注射方式给DIO小鼠输注chow-EVs或HFD-EVs（图2A）。经过4周治疗后，chow-EV处理的DIO小鼠表现出体重显著降低、脂肪质量减少、食物摄入量减少、能量消耗增加、RER降低以及脂肪细胞体积减小。相比之下，与对照DIO小鼠相比，HFD-EV处理的DIO小鼠未表现出上述变化（图2B-K）。各组之间的活动量无显著差异（图2L）。除全身代谢表型外，chow-EV处理还改善了DIO小鼠的肝功能，表现为肝脏重量减轻、肝内脂质积累减少以及血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平降低（图S2A-D）。在此基础上，研究者进一步比较了人源 AT-EVs 的代谢效应。DIO小鼠接受从健康体重人群（healthy-EVs）或肥胖人群（OB-EVs）中提取的AT-Evs，静脉注射持续4周（图2M）。与OB-EV处理组和对照DIO小鼠相比，healthy-EV处理的DIO小鼠表现出体重和脂肪质量显著降低、食物摄入量减少、能量消耗增加、RER降低以及脂肪细胞体积减小（图2N-X）。综上，健康来源的AT-EVs具有明确的抗肥胖和促能量稳态作用，而肥胖来源的AT-EVs则丧失了这种代谢保护效应。

图2：健康细胞外囊泡减轻肥胖

图S2：健康体重个体的脂肪组织来源AT-EVs减轻肥胖（与图2相关）

接下来，研究者通过静脉注射方式给8周龄的ob/ob小鼠输注chow-EVs或载体，持续4周（图S2E）。结果显示，与载体处理的ob/ob小鼠相比，chow-EV处理的ob/ob小鼠在体重、脂肪质量、食物摄入量、能量消耗、RER或脂肪细胞体积方面均无差异（图S2F-O）。同样，用chow-EVs或载体处理4周的瘦素受体（LepR）缺陷型db/db小鼠，两组之间在体重、脂肪质量、食物摄入量、能量消耗、RER或脂肪细胞体积方面也无显著差异（图S2P-Z），表明AT-EVs对能量平衡的影响依赖于瘦素信号通路。

2、AT-EVs对于调节下丘脑瘦素-黑皮质素信号通路至关重要

在ob/ob或db/db肥胖小鼠中未观察到抗肥胖效应，表明AT-EVs对能量平衡的作用依赖于完整的瘦素信号通路。因此，研究者研究了AT-EVs在瘦素相关效应机制中的作用。在禁食和再进食条件下，研究者观察到Rab27 KO小鼠与Rab27 WT小鼠的白色脂肪组织（WAT）瘦素基因表达和血浆瘦素水平无差异（图3A、图3B）。此外，两组小鼠之间其他影响食物摄入和能量消耗的外周激素（包括瘦素、胆囊收缩素、胰高血糖素样肽-1（GLP-1）、胃饥饿素、胃抑制肽、肽YY和胰岛素）的血浆水平也无差异（图S3A-E）。鉴于瘦素对能量平衡的调节作用主要通过下丘脑LepR神经元介导，研究者评估了AT-EVs对中枢瘦素信号的调节效应。在禁食和再进食条件下，Rab27 KO小鼠与Rab27 WT小鼠的下丘脑LepR基因表达无差异（图3C）。然而，再进食后，Rab27 KO小鼠下丘脑中STAT3（一种瘦素作用的生物标志物）的磷酸化蛋白水平显著低于Rab27 WT小鼠（图3D、图3E）。瘦素信号通过激活下丘脑黑素皮质素（Melanocortin）系统抑制食欲并促进能量消耗。因此，研究者评估了Rab27 KO和Rab27 WT小鼠在进食和禁食条件下的下丘脑黑素皮质素系统激活情况。在再进食期间，Rab27 KO小鼠表现出Agrp和Npy的mRNA表达增加以及Pomc mRNA表达降低，而禁食条件下两组之间这三种神经肽的表达水平相当（图3F、图S3F）。此外，在再进食期间，Rab27 KO小鼠表现出黑素皮质素-4受体（MC4R）通路下游效应分子的表达减少，包括促甲状腺激素释放激素（Trh）、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、SIM bHLH转录因子1（Sim1）和脑源性神经营养因子（BDNF）（图3G）。MERFISH分析证实，与Rab27 WT小鼠相比，再进食后Rab27 KO小鼠中fos+ Pomc和fos+ MC4R神经元数量减少，而fos+ Agrp神经元数量增加（图3H、图3I）。值得注意的是，其他参与摄食和能量消耗调控的下丘脑通路在两组之间并未出现显著变化（图S3G）。综上所述，AT-EV阻断损害了下丘脑瘦素-黑素皮质素系统的激活

拓展阅读：瘦素与ARGP、NPY、POMC、MC4R

Leptin是一种由脂肪组织分泌的激素，是机体能量稳态调控的关键信号分子，其可通过血脑屏障进入下丘脑弓状核（Arcuate nucleus, ARC）来启动信号传导，从而调节摄食行为、能量消耗及体重平衡。

在ARC中，Leptin可以直接调控AgRP/NPY神经元和POMC神经元这两类核心神经元的活性及相关基因表达。其中，AgRP与NPY均为强效的促食欲因子，共表达于同一类促食欲神经元，Leptin可抑制其基因表达及神经元激活，减少食欲、抑制进食；而POMC神经元为抑食欲神经元，Leptin可以促进POMC基因表达并增强神经元的兴奋性。POMC进一步裂解后可生成α-MSH等活性肽，进一步发挥抑食和促能量消耗作用。

MC4R主要表达于下丘脑室旁核等摄食调控相关的脑区，是中枢黑皮质素系统中的关键效应受体。MC4R的活性主要受上游ARC神经元释放的两种配体共同调节：POMC来源的α-MSH可以激活MC4R，产生抑制摄食的效应。而AgRP则可以竞争性拮抗这一效应从而促进食欲。因此MC4R活性不直接由Leptin调控，而是取决于上游ARC神经元释放的α-MSH与AgRP之间的竞争。

Leptin作为能量稳态的核心调控激素，其作用依赖完整的信号通路，瘦素抵抗会导致AgRP/NPY过度激活、POMC功能受抑，进而引发肥胖。在Leptin的下游信号网络中，PI3K和STAT3通路具有尤为重要的作用。阻断PI3K信号会削弱Leptin对AgRP/NPY表达的抑制作用及对神经元的激活调控。同样，STAT3信号受损也会削弱POMC系统对瘦素刺激的响应。因此，这两条信号通路共同构成了Leptin发挥中枢代谢调控功能的重要分子基础。

图3：AT-EVs对调控下丘脑瘦素-黑素皮质素信号通路至关重要

图S3：AT-EVs通过调节下丘脑黑素皮质素系统对瘦素的反应来调控能量稳态（与图3相关）

随后，研究人员给NCD喂养的Rab27 KO和Rab27 WT小鼠单次腹腔注射瘦素（3 mg/kg），以评估AT-EVs对中枢瘦素反应的影响。瘦素处理后，Rab27 KO小鼠弓状核（ARC）中的c-Fos强度和pSTAT3蛋白水平均低于Rab27 WT小鼠（图3J、图3K）。由于瘦素通过抑制AgRP神经元和兴奋POMC神经元来激活下丘脑黑素皮质素系统，研究者研究了AT-EVs在这些反应中的作用。首先，将表达Rab27a小干扰RNA（siRNA）的AAV（AAV-siRab27a）或其对照（AAV-control）注射到AgRP-Cre/Rosa26-LSL-tdTomato或POMC-Cre/Rosa26-LSL-tdTomato小鼠的脂肪组织中，这些小鼠分别在AgRP或POMC神经元中特异性表达tdTomato荧光蛋白。AAV注射2周后，AAV-siRab27a注射小鼠的AT-EV产生受到显著抑制（图S3H、图S3I）。研究者观察到AAV-siRab27a和AAV-control注射小鼠之间的神经元静息膜电位或基础放电频率无差异。然而，与AAV-control注射小鼠相比，AAV-siRab27a注射小鼠表现出瘦素诱导的AgRP神经元超极化和放电频率受到抑制（图3L-N）。此外，在POMC神经元中，两组基础静息膜电位和放电频率同样无显著差异，但AAV-siRab27a处理后，瘦素诱导的POMC神经元放电频率增加被明显减弱（图3O-Q）。上述结果提示，AT-EV阻断损害了AgRP和POMC神经元对瘦素的反应。

接下来，研究者用外源性瘦素处理普通饲料喂养的Rab27 KO和Rab27 WT小鼠，以阐明AT-EVs在瘦素作用中的功能。瘦素显著抑制了Rab27 WT小鼠的食物摄入和体重，而这些效应在Rab27 KO小鼠中明显减弱（图S3J）。为进一步验证AT-EVs在维持瘦素作用中的关键作用，研究人员将AAV-siRab27a（Rab27a KD ob/ob小鼠）或其对照（Rab27a WT ob/ob小鼠）注射到ob/ob小鼠的脂肪组织中，持续2周，然后用载体或瘦素（1mg/kg，腹腔注射）连续处理7天。结果显示，瘦素抑制了Rab27a WT ob/ob小鼠的食物摄入和体重，但这些效应在Rab27a KD ob/ob小鼠中显著减弱（图S3K），表明AT-EVs对维持瘦素作用至关重要。此外，为进一步评估AT-EVs是否能恢复瘦素反应性，研究人员给DIO小鼠用chow-EVs（chow-EV-DIO）或载体处理4周，然后用载体或瘦素连续处理7天（图3R）。结果表明，单纯给予瘦素并不能改变DIO小鼠的体重、脂肪质量、脂肪细胞大小或食物摄入量。但瘦素处理的chow-EV-DIO小鼠表现出体重、脂肪质量、食物摄入量和脂肪细胞大小显著降低（图3S-X）。

随后，研究者采用立体定位注射方式，向DIO小鼠弓状核注入携带LepR siRNA的AAV（LepR^{ARC KD}）或对照AAV（LepR^{ARC WT}）。免疫染色证实HFD LepR^{ARC KD}小鼠ARC中LepR表达显著降低（图S3L）。LepR^{ARC KD}和LepR^{ARC WT}小鼠的脂肪组织瘦素mRNA水平无差异（图S3M）。随后，分别给LepR^{ARC KD}和LepR^{ARC WT}小鼠静脉注射chow-EVs或载体对照。值得注意的是，与载体处理的LepR^{ARC WT}DIO小鼠相比，chow-EV处理的LepR^{ARC WT} DIO小鼠表现出体重、脂肪质量和食物摄入量降低，且能量消耗增加。然而，chow-EV处理的LepR^{ARC KD}小鼠与对照LepR^{ARC KD}小鼠之间在体重、脂肪质量、食物摄入量、能量消耗和脂肪细胞大小方面无差异（图S3N-S）。

除LepR外，研究人员还给DIO小鼠的室旁核（PVN）立体定位注射表达MC4R siRNA的AAV（MC4R KD）或对照AAV（MC4R WT），持续2周。MC4R KD小鼠中MC4R表达降低，且MC4R KD和MC4R WT小鼠的脂肪组织瘦素mRNA水平无差异（图S3T、图S3U）。AT-EV给药4周后，与载体处理的WT对照小鼠相比，chow-EV处理的MC4R WT小鼠表现出体重、脂肪质量和食物摄入量降低，且能量消耗增加。然而，载体处理和chow-EV处理的MC4R KD小鼠之间在体重、脂肪质量、食物摄入量或能量消耗方面无差异（图S3V-Z），表明抑制瘦素-下丘脑黑素皮质素轴减弱了AT-EV介导的能量平衡调节。综上所述，这些数据支持AT-EVs对维持下丘脑黑素皮质素系统的瘦素反应性至关重要。

3、AT-EVs通过直接作用于下丘脑瘦素-黑皮质素回路来调节能量稳态

为确定AT-EVs是否可直接作用于下丘脑，研究者采用脂肪组织特异性的EV示踪策略进行追踪。首先，通过将表达Cre重组酶的AAV（AAV-Cre）注射到CD63^Flag EGFP-mCherry^f/f小鼠的脂肪组织中进行体内AT-EVs的示踪和筛选（图4A），这些小鼠在修饰的CD63上游携带floxP-floxP终止序列，而CD63是EV膜中高度富集的Marker蛋白。AAV注射4周后，研究者分析不同器官的荧光强度，观察到脑组织中mCherry荧光显著积累（图4B）。随后，将表达palmmCherry（一种荧光EV报告基因）的AAV（AAV-palmmCherry）注射到WT小鼠的脂肪组织中，持续2周。之后，研究者对全脑进行mCherry荧光的综合性示踪和筛选。在多个脑区观察到mCherry荧光，包括海马和皮层，其中下丘脑的积累最强。mCherry荧光在多个下丘脑核团中富集，包括腹内侧下丘脑（VMH）、背内侧下丘脑（DMH）和室旁核（PVN），其中ARC的积累最高（图4C-F）。免疫染色显示mCherry与神经元标志物NeuN的共定位程度高于与小胶质细胞标志物IBA-1或星形胶质细胞标志物GFAP的共定位，表明AT-EVs具有明显的神经元偏好性（图S4A）。值得注意的是，ARC中的LepR+神经元也检测到了mCherry信号，这为AT-EVs直接调控下丘脑瘦素-黑素皮质素通路提供了进一步证据（图S4B）。

图4：AT-EVs直接作用于中枢神经系统调控能量稳态

图S4：AT-EVs直接作用于中枢神经系统调控能量稳态（与图4相关）

接下来，研究者研究了AT-EVs的中枢作用是否参与其对能量稳态的调节。首先，研究者通过脑室内（i.c.v.）给药方式给普通饲料喂养的Rab27 KO小鼠注射chow-EVs（chow-EV^i.c.v.-Rab27 KO）或其对照，以评估AT-EVs是否参与能量稳态的中枢调节（图4G）。与载体处理的Rab27 KO小鼠相比，chow-EV处理的Rab27 KO小鼠表现出体重和每日食物摄入量降低、能量消耗增加、RER降低以及脂肪细胞体积减小（图4H-J、S4C-I）。然后，研究者在禁食和再进食条件下对Rab27 WT、载体^i.c.v.-Rab27 KO和chow-EV^i.c.v.-Rab27 KO小鼠进行全脑c-Fos（神经元活性标志物）筛选，以评估神经元活性变化。结果发现，禁食期间，三组小鼠脑区之间的c-Fos信号无差异。然而当再进食后，与Rab27 WT小鼠相比，Rab27 KO小鼠在多个脑区（包括嗅球、海马、脑干和下丘脑）的c-Fos信号显著降低。chow-EV^i.c.v.-Rab27 KO和Rab27 WT小鼠在大多数脑区的c-Fos信号相似（图4K）。进一步聚焦下丘脑后发现，Rab27 KO小鼠在包括ARC、DMH和PVN等多个核团中的c-Fos强度显著降低。而在补充chow-EV后，这些下丘脑区域的c-Fos强度无差异（图4L、图S4J），表明中枢AT-EV补充可以缓解AT-EV抑制引起的异常神经元活动。此外，chow-EV^i.c.v.-Rab27 KO小鼠的下丘脑瘦素-黑素皮质素通路组分的基因表达与Rab27 WT小鼠相当，表明中枢AT-EV补充恢复了AT-EV缺失导致的中枢瘦素信号受损（图4M-O、图S4K、图S4L）。综上所述，这些结果表明AT-EVs直接作用于下丘脑瘦素-黑素皮质素回路。

4、miRNAs负责AT-EVs对能量稳态的影响

细胞外囊泡携带多种生物活性货物，其中miRNA是主要组成部分。为研究miRNA是否介导AT-EVs对能量平衡的影响，研究者构建了表达miRNA加工的关键酶Dicer的siRNA AAV（AAV-siDicer），并将其注射到普通饲料喂养小鼠的脂肪组织中。随后，将从AAV-siDicer（SiDicer-EVs）和AAV-scramble（scr-EVs）中提取的AT-EVs静脉注射给DIO小鼠（图5A-C）。与载体处理的DIO小鼠相比，scr-EV处理的DIO小鼠表现出体重和脂肪质量显著降低、每日食物摄入量减少、能量消耗增加、RER降低、脂肪细胞体积减小以及瘦素mRNA水平降低。然而，SiDicer-EV和载体处理的DIO小鼠之间在体重、脂肪质量、每日食物摄入量、能量消耗、脂肪细胞大小或瘦素mRNA水平方面无差异（图5D-O）。在腹腔注射瘦素后，scr-EV处理的DIO小鼠表现出比载体处理小鼠更高的ARC中c-Fos强度和pSTAT3表达，而SiDicer-EV和载体处理的DIO小鼠之间在c-Fos强度和pSTAT3表达方面无差异（图5P-R）。这些结果表明miRNA促进了AT-EVs的瘦素增敏和抗肥胖效应。

图5：miRNA促进AT-EVs在调控能量稳态中的作用

为鉴定AT-EVs中负责瘦素增敏的miRNA，研究者利用深度RNA测序分析了健康EVs（healthy-EVs）和肥胖EVs（OB-EVs）中的miRNA谱。与healthy-EVs相比，OB-EVs中有28个miRNA下调，19个miRNA上调（图6A；表S1）。对chow-EVs与HFD-EVs的平行分析鉴定出14个下调和18个上调的miRNA（图6B；表S2）。对这些显著差异表达miRNA的靶基因鉴定表明，人和小鼠中可能存在一个广泛的miRNA介导的调控网络，影响瘦素敏感性。具体而言，肥胖AT-EVs中下调的miRNA被预测通过靶向LepR信号的负反馈调节因子来维持瘦素敏感性，包括蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型2（PTPN2）、细胞因子信号抑制因子3（SOCS3）、磷酸酶与张力蛋白同源物（PTEN）和活化STAT3蛋白抑制剂（PIAS3）。相反，肥胖AT-EVs中上调的miRNA被预测通过靶向LepR及其下游效应分子（包括LepR、酪氨酸蛋白激酶JAK2（JAK2）和信号转导与转录激活因子3（STAT3））来抑制瘦素信号（图6C-F；表S3、S4）。与此一致的是，chow-EV给药降低了ARC中SOCS3、PIAS3、PTEN和PTPN2的水平，而这一效应被AT-EVs中的miRNA抑制所减弱，从而支持健康来源AT-EV miRNA具有潜在的瘦素增敏作用（图S5A）。

为确定这些候选瘦素增敏miRNA与人体体重状态之间的关联，研究者收集了两个临床队列。第一个队列包含60名正常体重（18.5kg/m² ≤ BMI < 25kg/m²）和超重/肥胖（25kg/m² ≤ BMI）个体。与正常体重个体相比，超重/肥胖个体的血清EV中五种瘦素增敏miRNA水平显著降低，其中miR-148a-3p、miR-30a-3p和miR-181d-5p与BMI呈负相关（图6G-6N、图S5B、图S5C；表S5）。在第二个队列的50名接受Roux-en-Y胃旁路术的肥胖患者中，miR-148a-3p、miR-30a-3p和miR-181d-5p的血清EV水平在术后6个月升高（图6O-Q；表S6）。双荧光素酶实验证实这些miRNA直接靶向SOCS3、PIAS3和PTEN（图S5D-I）。在小鼠中，miR-148a-3p和miR-30a-3p的血清EV水平在DIO小鼠中下降，而在ob/ob小鼠中保持高水平（图S5J-M），这些结果进一步强化了上述miRNA在AT-EVs中作为瘦素增敏因子的作用。

图6：健康EV中富集的miRNA发挥瘦素增敏作用

图S5：健康体重AT-EVs中富集的miRNA发挥瘦素增敏作用（与图6相关）

随后，研究者通过将特异性在神经元中表达miR-148a-3p和miR-30a-3p的AAV（AAV-hsyn-miRNAs）或其对照（AAV-hsyn-mCherry）注射到DIO小鼠的ARC中，研究了miR-148a-3p和miR-30a-3p在AT-EVs瘦素增敏和抗肥胖效应中的潜在作用（图6R、图6S）。AAV注射4周后，与AAV-hsyn-mCherry处理的DIO小鼠相比，AAV-hsyn-miRNA处理的DIO小鼠表现出体重和每日食物摄入量降低、能量消耗增加、RER降低以及瘦素mRNA水平下降（图6T-X、图S5N）。一致地，AAV-hsyn-miRNA处理的DIO小鼠在腹腔注射瘦素治疗后显示出更高的c-Fos和pSTAT3水平。这些结果表明ARC神经元中的miR-148a-3p和miR-30a-3p可增强瘦素敏感性并抑制肥胖（图6Y、图6Z）。

为评估在脂肪组织中过表达瘦素增敏miRNA是否具有治疗DIO的潜力，研究者将表达miR-148a-3p和miR-30a-3p的AAV（AAV-miRNAs）或其对照（AAV-scramble）注射到DIO小鼠的脂肪组织中（图S5O、图S5P）。AAV注射4周后，与对照DIO小鼠相比，AAV-miRNA处理的DIO小鼠表现出显著的体重减轻、脂肪质量减少、食物摄入量降低、能量消耗增加、RER降低以及瘦素mRNA水平下降（图S5Q-X）。

5、使用工程化AT-EVs靶向CNS递送瘦素增敏miRNAs可缓解肥胖

接下来，研究者探索了这些发现在治疗肥胖方面的潜在转化价值，重点阐明AT-EVs靶向中枢神经系统的分子机制。首先，研究者将等量PKH26标记的来自普通饲料喂养小鼠的内脏脂肪组织EVs（VAT-EVs）、皮下脂肪组织EVs（SAT-EVs）和棕色脂肪组织EVs（BAT-EVs）注射到普通饲料喂养的受体小鼠中，以确定它们是否具有相似的下丘脑靶向效率。结果显示，VAT-EVs处理小鼠的ARC中PKH26信号显著强于SAT-EVs或BAT-EVs处理小鼠，表明VAT-EVs具有更优的下丘脑靶向能力（图S6A、图S6B）。为鉴定负责中枢神经系统转运的VAT细胞来源，研究者将VAT分离为脂肪细胞和非脂肪细胞的基质血管组分细胞（SVCs）。从这两种细胞群中收集EVs，用PKH26标记后静脉注射到受体小鼠中。与SVC-EVs处理小鼠不同，脂肪细胞Ad-EVs处理小鼠的下丘脑显示出显著的荧光信号，表明能够转运至下丘脑的AT-EVs主要来源于脂肪细胞（图S6C、图S6D）。为进一步评估Ad-EVs对能量稳态和中枢瘦素敏感性的调节作用，将来自普通饲料喂养小鼠的Ad-EVs（chow-Ad-EVs）和高脂饮食喂养小鼠的Ad-EVs（HFD-Ad-EVs）静脉注射到DIO小鼠中。经过4周的EV干预，chow-Ad-EVs处理的DIO小鼠表现出体重和脂肪质量降低、食物摄入量减少、能量消耗增加、RER降低、脂肪细胞体积减小以及中枢瘦素敏感性增强，而HFD-Ad-EVs则无这些效应（图S6E-R），表明瘦素增敏EVs主要来源于脂肪细胞。

此外，为评估AT-EVs对下丘脑靶向的特异性，研究者进一步比较了AT-EVs与肝脏来源EVs（L-EVs）的中枢分布差异。在将等量PKH26标记的AT-EVs和肝脏来源EVs（L-EVs）静脉注射到受体小鼠中后，AT-EVs处理小鼠表现出强烈的下丘脑荧光，而L-EVs处理小鼠仅检测到可忽略的信号（图S7A、图S7B）。为验证AT-EVs向中枢神经系统的转运是否依赖于膜蛋白，用胰蛋白酶预处理荧光PKH26标记的AT-EVs（胰蛋白酶化EVs）以切割膜蛋白，然后静脉注射到受体小鼠中。与对照EVs处理小鼠相比，胰蛋白酶化EVs处理小鼠下丘脑中AT-EVs的荧光信号显著降低，表明AT-EVs以膜蛋白依赖性方式靶向脑组织（图S7C、图S7D）。为鉴定引导AT-EVs靶向中枢神经系统的特异性膜蛋白，研究者使用无偏倚鸟枪法质谱，对AT-EVs和L-EVs进行蛋白质组学分析。与L-EVs相比，研究者在AT-EVs中鉴定出115种独特或高度富集（倍数变化>25）的蛋白质。亚细胞定位和功能分析显示，其中71种为膜蛋白，10种与细胞迁移和黏附相关，这些功能与EVs结合细胞受体密切相关（图S7E-G；表S7）。其中，研究者筛选出五种可能参与中枢靶向的候选膜蛋白：ADGRE5（在白细胞募集和迁移中发挥作用）、CD9（在调节整合素依赖性细胞迁移和侵袭中发挥作用）、ITGA7（在调节侵袭和迁移中发挥作用）、MCAM（作为允许淋巴细胞跨屏障迁移的黏附受体发挥作用）和SIRPα（在调节整合素介导的单核细胞黏附和跨内皮迁移中发挥作用）（图S7H）。为确定这五种候选分子在AT-EVs大脑靶向特性中的作用，研究者生成了表达针对这五种候选分子siRNA的AAVs并将其递送至脂肪组织。AAV干预2周后，通过蛋白质印迹法证实了这些蛋白质在脂肪组织中的下调（图S7I）。随后，收集不同组的AT-EVs，用PKH26标记后静脉注射到受体小鼠中。与AAV-scramble注射脂肪组织来源的EVs处理小鼠相比，AAV-siSIRPα和AAV-siMCAM处理脂肪组织来源的EVs处理小鼠表现出显著降低的下丘脑荧光，表明SIRPα和MCAM是AT-EVs靶向中枢神经系统的分子基础（图S7J、图S7K）。

其次，研究者构建了工程化EVs以实现miRNA向中枢神经系统的靶向递送。为增强EV的脑靶向能力，研究者用携带编码SIRPα和MCAM质粒的慢病毒（LV-SM）或其对照（LV-control）转染3T3-L1细胞，并从分化后的 LV-SM 转染3T3-L1脂肪细胞中纯化工程化EVs（SM-EVs）和对照EVs（control-EVs）（图7A）。透射电镜和NanoSight分析显示SM-EVs与control-EVs之间在物理性质上无差异（图7B、图7C）。蛋白质印迹法显示3T3-L1脂肪细胞及其来源EVs中SIRPα和MCAM蛋白水平增加（图S7L、图S7M）。

图7：利用工程化EVs向中枢神经系统靶向递送瘦素增敏miRNA可缓解肥胖

图S6：普通饲料喂养小鼠来源的脂肪细胞细胞外囊泡（Ad-EVs）可减轻DIO小鼠的肥胖并增强中枢瘦素敏感性（与图7相关）

图S7:利用工程化EVs向中枢神经系统靶向递送瘦素增敏miRNA可缓解肥胖（与图7相关）

接下来，研究者通过将等量的红色荧光PKH26染料标记的SM-EVs、control-EVs和AT-EVs静脉注射到受体小鼠中，评估了工程化EVs的大脑靶向能力。离体荧光成像显示，SM-EVs注射小鼠中枢神经系统的PKH26荧光显著高于control-EVs和AT-EVs注射小鼠，证实了其在增强EV大脑靶向方面的适用性（图7D）。PKH26荧光信号在下丘脑中富集（图7E、图7F）。此外，为确认SM-EVs能够将miRNA货物递送至下丘脑，研究者将Cy3标记的人特异性miRNA hsa_miR-302f（无小鼠同源物）通过电穿孔加载到SM-EVs和control-EVs中。miRNA加载效率约为40%（图7G）。随后，将裸露的Cy3标记hsa_miR-302f以及电穿孔进入SM-EVs或control-EVs的hsa_miR-302f注射到普通饲料喂养的受体小鼠中，持续48小时。在下丘脑观察到Cy3荧光，且SM-EVs处理小鼠的荧光强度显著高于control-EVs处理或裸露miRNA处理小鼠（图7H、图7I）。为进一步验证SM-EVs递送至下丘脑的miRNA能否发挥其调节功能，研究人员将携带hsa_miR-302f 3' UTR mCherry报告基因的AAV（AAV-reporter）注射到受体小鼠的ARC中，3天后给予加载hsa_miR-302f的SM-EVs（hsa_miR-302f-EVs）或其对照（control-EVs）。EV注射2周后，与control-EVs处理小鼠的ARC相比，hsa_miR-302f-EVs处理小鼠的ARC表现出hsa_miR-302f水平增加和mCherry荧光强度降低（图7J-L），表明miRNA成功递送至下丘脑并发挥功能调节作用。

最后，研究者评估了通过工程化EVs将瘦素增敏miRNA递送至中枢神经系统所产生的抗肥胖效应。将裸露的miR-148a-3p和miR-30a-3p（control/miRNAs）或封装在SM-EVs中的miRNAs静脉注射到DIO小鼠中（图7M、图7N）。经过4周的EV治疗，与control/miRNAs处理的DIO小鼠相比，SM-EV/miRNA处理的小鼠表现出体重降低、每日食物摄入量减少、能量消耗增加以及中枢瘦素敏感性增强（图7O-X）。综上所述，这些结果表明向中枢神经系统靶向递送瘦素增敏miRNA是增加瘦素敏感性和治疗肥胖的有效策略。

总结

本研究发现脂肪细胞来源的细胞外囊泡是维持中枢瘦素敏感性和能量稳态的重要介质。研究首次从整体层面揭示，脂肪组织与大脑通讯受损是中枢瘦素抵抗的重要原因，而脂肪细胞外泌体是这一通讯的关键载体。健康脂肪来源外泌体可直接靶向下丘脑瘦素受体神经元，并通过递送miR-148a-3p、miR-30a-3p等“瘦素增敏”miRNA，抑制SOCS3、PIAS3等瘦素信号负调控因子，从而维持瘦素敏感性。肥胖状态下，这类miRNA在外泌体中显著减少，导致下丘脑瘦素信号减弱、黑素皮质素系统激活受损，进而引发瘦素抵抗、摄食增加、能量消耗下降和体重上升。进一步地，研究人员构建了过表达SIRPα和MCAM的工程化外泌体，以增强其中枢靶向递送能力，实现“瘦素增敏”miRNA向脑内递送，并在肥胖小鼠中成功恢复瘦素敏感性、降低体重，为肥胖治疗提供了新的潜在策略。