代谢学人

Cell Metabolism：肠菌分泌BefA来和β-cell说说话

撰文 | 郭钰涵 徐梓禾 武霞 陈俊桐 于柳 邱瑾

编辑 | 孟美瑶 

校对 | 武霞

背景介绍

β细胞是调节血糖所必需的一种胰腺内分泌细胞，它能产生胰岛素。糖尿病患者由于自身免疫性被破坏或长期胰岛素抵抗而缺乏功能性β细胞。β细胞替代策略主要是通过刺激β细胞的发育和增殖来恢复内源性胰岛素的产生。针对这类疾病，一种很有前途的潜在治疗方法是再生胰岛衍生蛋白（regenerating islet-derived protein, Reg），该蛋白最初是在新生β细胞中发现的。Reg是C型凝集素的一部分，基于基因编码蛋白的结构，Reg家族蛋白分为 RegⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ亚型，在Reg的多种亚型中RegⅢ（Reg3）作用更为突出。Reg3蛋白也有多种亚型，在小鼠中有4个Reg3成员，被称为Reg3α、Reg3β、Reg3δ和Reg3γ，而在人类中已知的只有Reg3α和Reg3γ两种。有研究发现，Reg3蛋白是一种有效的膜成孔的抗菌防御蛋白，对肠道屏障的完整性至关重要。Reg3蛋白的表达需要微生物刺激，在无菌条件下或抗生素治疗的情况下，其表达被抑制，而补充特定细菌可以增强其表达。Reg3在许多器官中起着调节作用，包括肝脏、肠道、胰腺、肺、心脏、皮肤和神经系统。Reg3还调控多器官代谢稳态，有研究表明Reg3蛋白可保护β细胞、肝细胞和角化细胞免受损伤，并促进细胞再生。另外，Reg3蛋白也在细胞增殖、抗菌防御和抑制细菌转移等方面发挥重要作用。越来越多的证据表明，通过微生物群的改变或外源性Reg3蛋白的加入可以改善β细胞功能，组织特异性过表达Reg3基因可促进更好的全身代谢，暗示Reg3蛋白可能通过局部旁分泌或自分泌来发挥循环作用。然而，由于Reg3蛋白具有多效性作用，不仅能促进β细胞的增殖，同时也能导致腺泡细胞、肠道、肝细胞和神经细胞的增殖，因此不能对胰岛进行特异性的治疗作用。目前还没有发现Reg3的气孔形成活性与其对胰腺的影响之间的联系。

作者在2016年发表的文章里提到，斑马鱼幼体的β细胞数量在孵化后的最初几天内稳步增加。然而，在无菌环境中饲养的斑马鱼幼体保持了与孵化前相同的β细胞数量。而将无菌环境中的鱼暴露在特定的细菌中，它们的β细胞数量又恢复到正常水平。也就是说无菌斑马鱼幼体的β细胞数量不增加，驻留微生物可促进斑马鱼的β细胞发育，并发现了一种分泌型细菌蛋白，可以挽救无菌（GF）幼体β细胞的发育，作者将其命名为β细胞扩增因子A（BefA）。BefA是一种29-kDa蛋白，由来自斑马鱼、小鼠和人类等宿主的肠道细菌亚群产生。同时，作者还发现与斑马鱼维氏气单胞菌BefA仅有34%氨基酸相似的人类克雷伯菌BefA同源物可以挽救斑马鱼的β细胞群，这表明BefA与其远端同源物中共享的结构特征可以发挥促进β细胞发育的作用，并提高BefA同源物在多个宿主物种中扩增的可能性。

通过对原始BefA及其功能同源物的氨基酸序列进行分析，作者发现其序列与脂质结合的SYLF结构域（命名为基础蛋白SH3YL1、Ysc84p、Lsb4p和FYVE，普遍存在于所有生命体）相似。SYLF结构域很普遍，来自酵母、植物和哺乳动物的含SYLF特征的真核蛋白与细胞或细胞器膜有关，但仅在少数蛋白质中研究了它们的作用机制，例如对酵母、哺乳动物和植物的研究表明SYLF结构域通过与肌动蛋白丝和/或膜脂结合，协调包括内吞作用在内的多种复杂生物过程。作者描述了一种细菌SYLF蛋白的结构，并表明它诱导人工合成膜的缺失与渗漏和囊泡形成以及参与了细菌细胞完整性的损失。此外，有研究发现，BefA可以通过多种途径从肠道传播到胰腺，这表明了微生物群分泌物对全身的影响比代谢物更大。最后，作者发现BefA的β细胞扩增活性在小鼠中是保守的，需要其膜通透性活性，而宿主来源的膜通透性Reg3蛋白足以模拟BefA对胰岛的影响。通过研究BefA的生化特性，作者揭示了膜通透性是细菌和宿主蛋白刺激β细胞扩增的共同机制。

敲黑板啦！

1、分泌的细菌BefA蛋白补充了无菌斑马鱼和小鼠的β细胞缺乏

2、BefA从肠腔运输到胰腺，直接作用于胰岛

3、BefA的SYLF结构域可渗透细胞膜并刺激β细胞的生长

4、膜通透性是诱导β细胞生长的必要和充分条件

研究结果

1. BefA的结构揭示了其功能性SYLF结构域

为了解BefA是如何发挥作用的，作者将其3D原子结构解析到1.3A˚分辨率，揭示了一个紧凑的部分β桶C端结构域，两侧有3个α螺旋，氨基端有5个α螺旋（图1A和1B）。螺旋1（H1）的位置类似于晶体堆积结构（图1A-1D）。最近报道了来自类鼻疽伯克霍尔德菌（简称类鼻疽菌）的远亲蛋白BPSL1445的SYLF结构域的核磁共振（NMR）结构，BefA的高分辨率晶体结构证实了这项报道，它们都是SYLF结构域折叠结构的第一批代表。为了确定与BefA在β细胞上的活性相对应的特征，作者比较了原始的BefA和产气菌K.同源物（图S1A），它们都增加了GF幼体斑马鱼中的β细胞。作者通过使用迭代线程程序集细化（I-TASSER）在BefA结构上模拟了产气菌K.的同源物。尽管序列保守性较低，但预计从残基99开始，它们具有高度的结构相似性（RMSD=0.84A˚）（图1C）。产气菌K.同源物中N端α螺旋H1-H3的缺失表明这些序列对其功能是非必要的。BefA与类鼻疽菌BPSL1445 的NMR结构比对也显示了在SYLF结构域上有一个共同的主干折叠（RMSD=1.8A˚；图S1B）。此外，作者利用I-TASSER预测了来自酵母（Ysc84）和人类（SH3YL1）的其他SYLF结构域的三维结构，结果表明两种预测模型从残基99开始，都与BefA结构高度相似（RMSD=1.62A˚和1.92A˚；图S1B）。保守结构域数据库定义了BefA中的SYLF结构域（从114位残基开始，到H4中间（图S1A）），但本研究的结构分析表明，保守的SYLF结构域包括从残基99开始的整个螺旋（图1C）。

通过这些对BefA结构的研究发现，BPSL1445和产气肠杆菌的同源物都能够促进β-cell功能，通过序列对比发现：与BefA结构序列相似地都包含C端部分中的SYLF结构域，作者扩大了对细菌BefA同源物的搜索，重点关注SYLF序列。在水生和陆地环境中的环境和宿主相关细菌中发现了编码含SYLF蛋白的基因（图S1C）。研究确定了更多几乎完全由SYLF结构域组成的同源物的例子，如产气菌K.和类鼻疽菌同源物。对原核生物和真核生物的含SYLF蛋白长度的调查发现，原核生物的平均蛋白长度仅仅是单一的SYLF结构域，而真核生物的则是更长的多结构域序列（图S1D）。

为了测试BefA的SYLF结构域是否足以调节其对β细胞的促增殖作用，作者克隆并表达了两个截断的变体，一个包含整个SYLF区域（BefA99），另一个对应于C端紧凑的部分β桶与侧翼α螺旋（BefA133）（图1D）。作者发现，BefA99在挽救GF β细胞扩增方面与全长BefA有同样的效果（图1E和1F），而BefA133的截断则挽救了部分的β细胞数量（图1F），这说明SYLF结构域对诱导β细胞增殖非常重要。

图1. BefA的结构揭示了赋予其功能的SYLF结构域

附图1. 不同SYLF结构域蛋白质的氨基酸比对和系统发育分析

2. BefA诱导细胞膜的通透性

SYLF结构域广泛存在，但其机制仅在少数蛋白质中进行了研究。对酵母、植物和哺乳动物的研究表明，SYLF结构域通过与肌动蛋白丝和/或膜脂结合，调节复杂的生物过程，如运动和内吞作用。因此，作者研究了BefA与F-肌动蛋白和脂质的相互作用。

酵母Ysc84p在其N端SYLF结构域中包含肌动蛋白结合功能，并与BefA共享一些肌动蛋白结合残基。在F-肌动蛋白共沉淀试验中，作者富集了阳性对照皮质蛋白，但未检测到BefA或BefA99的富集（图S2A）。一些SYLF结构域蛋白可结合磷脂酰肌醇（PIPs）。作者没有看到BefA与PIPs的结合，但看到了BefA与带负电荷的磷脂酰丝氨酸（PS）和心磷脂的一致结合（图S2B）。钙的加入促进了与带负电荷的脂质的结合，但并没有改变结合方式（图S2B）。真核生物SYLF结构域中大量脂质结合残基在BefA中是保守的。作者在这些残基中产生了几个点突变，并发现BefA变体对PS的亲和力明显降低（图S2B）。

为了测试BefA与脂质双分子层的相互作用，作者将BefA或BefA99与合成的德克萨斯红标记的巨大脂质囊泡一起孵育（图2A）。在BefA或BefA99存在的情况下，能观察到高频率的多泡囊泡（图2A和2B），中性和带负电荷的膜都有类似的囊泡。BefA处理也会导致囊泡浓度增加（图2C和S2C），这表明多囊泡状的囊泡是由较大的囊泡出芽和碎裂形成的（图2D）。

膜通透性抗菌蛋白（AMPs）可诱导膜弯曲，并参与囊泡化。为了确定BefA是否损害了膜的完整性，作者对负载染料的囊泡进行了染料释放试验。用BefA或BefA99处理几乎没有导致小泡释放染料（直径≤100 nm）（图2E），但能从较大的囊泡中以浓度下降的方式释放染料（直径≤400 nm）（图2），这表明BefA可能对较低的膜曲率具有更高的亲和力。接下来，作者测试了PS结合减少的BefA突变体是否会降低囊泡的渗透活性。结果发现，与野生型（WT）BefA相比，BefAR195A（突变类型为：195位精氨酸突变，该位点可介导BefA与磷脂的相互作用）从中性和带负电荷的囊泡中释放的染料明显减少（图2G和2H）。

许多膜通透性抗菌蛋白（AMPs）可靶向细菌细胞膜破坏其完整性；因此，作者评估了BefA是否可以破坏细菌细胞膜的完整性。作者检测了从斑马鱼中分离出的两种革兰氏阳性芽孢杆菌和葡萄球菌。这些细胞的细胞膜很容易被洗涤剂、AMP和Reg3α破坏进而形成穿孔（图2I和2J）。BefA还诱导了两种分离株中的细菌膜通透性，在葡萄球菌中达到了与Reg3a相当的水平（图2I和2J）。作者还使用mCherry（mCh）-BefA融合蛋白测试了BefA是否结合了细菌。结果表明，mCh-BefA与芽孢杆菌外部明显结合，并且与未结合BefA的mCh蛋白没有结合（图2K和2L）。因此，BefA可以结合细菌。

作者推测，BefA破坏细胞膜的能力也传递了其β细胞的扩增活性。为了测试是否有另一种膜通透蛋白能做到这一点，作者将GF幼体暴露于Reg3γ（Reg3a的小鼠同源物）。Reg3γ足以将β细胞数量恢复到CV（Conventional animal，即普通级动物）或BefA处理的水平（图2M）。经Reg3γ处理后的GF幼体胰岛的整体形态与CV相似，表明AMP对发育中的细胞没有造成明显的损伤或损伤（图2N）。

      宿主AMPs通常在toll样受体（TLRs）的下游产生，它可识别微生物产物。β细胞和肠细胞都表达TLRs。为了检测BefA处理是否需要TLR信号，作者对携带myd88基因突变的幼体中的β细胞进行了定量分析。作者观察到，在常规饲养的WT和myd88-/-幼体之间的β细胞计数没有差异（图2O）。此外，用BefA处理GF myd88-/-幼体后，β细胞数量增加（图2O），这表明TLR信号在BefA作用中是非必要的。

图2. BefA诱导膜透性

附图2. BefA与F-actin和膜脂质的生化相互作用探讨

作者发现，膜通透蛋白可以扩增β细胞，这表明BefA可能直接作用于宿主细胞。为了可视化BefA的SYLF结构域与宿主细胞之间的相互作用，作者使用BefA99的荧光蛋白融合物（mCh-或mNeonGreen [mNG]-BefA99），它诱导了GF β细胞中类似WT BefA的增加，而荧光蛋白本身没有影响（图3A）。作者观察到mNG-BefA99分布到了分离的含有β细胞的解剖幼体肠道中。虽然在单独与mNG孵育的培养物中没有检测到mNG信号，但观察到了mNGBefA99与β细胞和胰岛素阴性细胞（小编注：这里的共定位结果说明BefA99也可以作用其他细胞，后面作者在limitation of study中也提到了“其他细胞中BefA的影响仍有待探索”）共定位的明显的点状标记（图3B）。平均21%（SD = 14%）的β细胞与mNG-BefA99相关，而只有1%（SD = 3%）的β细胞仅与mNG单独相关。为了确定这种相互作用的时间动态，作者对用mNG-BefA99处理过的分离的幼体胰岛细胞进行了成像。胰岛中的一个细胞亚群与mNG-BefA99最初显示出均匀的表面荧光，随后在暴露10 min后出现表面斑点，并可能在30 min时内化（图S3A）。接下来，作者测试了与BefA的直接相互作用是否会诱导幼体β细胞的增殖。作者从GF ins:gfp幼体中显微解剖胰岛（图S3B），并在体外用BefA或BefA99处理胰岛。48 h后，体外胰岛表现为状态良好，具有稳定的ins:gfp表达、无死亡细胞和形态正常（图S3C）。作者观察到，在经BefA或BefA99处理的外植体中，β细胞明显多于未经处理的胰岛（图3C和3D），这表明BefA的SYLF结构域可以直接诱导β细胞的扩增。

鉴于对BefA的直接作用模式的证据，作者试图确定它是否能在体内扩散到胰腺。从分泌BefA的肠腔开始的合理途径是通过血管系统或向肝胰管（HPD）回流，肝胰管通过胆汁和消化酶连接肝脏、胆囊、胰腺和肠道。为了证实肠腔内BefA可以影响胰腺β细胞，作者使用口服微凝胶向斑马鱼幼体的肠腔中直接输送一定剂量BefA。与对照组相比，即使在0.2 pg的最低剂量下，BefA的小剂量也足以增加β细胞（图3E）。

作者试图通过nkx2.2：gpf幼体观察BefA从肠道的传播，以观察肠道和胰腺内分泌细胞的重要解剖标志。灌胃mChBefA或mNG-BefA后，在肠腔内（图3F）和富含溶酶体的肠上皮细胞（LREs）（图S3D）中很容易可见荧光，这些细胞参与了活跃的、非选择性的蛋白质内化。不过没有在肠外检测到与BefA相关的荧光，考虑到强烈的管腔和LRE荧光信号，以及作者发现的即使是非常低剂量的BefA也能诱导β细胞扩增。由此得出结论，BefA特异性的宿主细胞相互作用超出了体内成像能力。接下来，作者利用斑马鱼突变体探索了BefA的传播途径。

为了测试BefA通过HPD回流的可能性，作者使用HPD发育受损的sox9b-/-斑马鱼。使用短链荧光脂质类似物BODIPY-FL C2测试了sox9b-/-幼体中HPD的通畅性，， BODIPY-FL C2因为不代谢而充满腔隙。在野生型幼体中，作者在胰腺内腔结构中检测到这种染料，可能是与肠道相邻的胰腺内导管（IPDs）（图3G）。在sox9b-/-幼体中，尽管在肠道中有明显的信号，但在胰腺中几乎没有发现荧光信号（图3G）。之后，测试了sox9b-/-幼体中HPD通畅性的丧失是否会通过影响微生物群或BefA进而影响β细胞发育的能力。与CV野生型动物相比，CVsox9b-/-幼体β细胞显著减少，与GF sox9b-/-幼体细胞数量相当（图3H），这与sox9b-/-幼体不能对内源性肠道微生物群的BefA产生反应一致。然而，在水中用BefA处理的GF sox9b-/-幼体的β细胞数量显著增加，这表明sox9b-/-幼体对BefA有反应能力，而添加到水流中的BefA的作用途径与肠道细菌产生BefA不同。为了验证这一点，作者通过微胃管给药方式向GF sox9b-/-幼体注射了大剂量的BefA。当直接运送到肠道时，BefA不能增加sox9b-/-幼体中的β细胞（图3H）。这些结果表明，BefA从肠腔内传递需要HPD的通畅，但BefA也能够通过另一种途径到达其目标细胞群。

因为BefA在添加到水流中时会引起β细胞的扩增，作者认为它可以通过皮肤和鳃被吸收到血液中。之后作者通过将BefA99注射到GF幼体的循环系统中，来检测BefA是否可以通过脉管系统传播。结果发现，注射了BefA99的幼体的β细胞明显多于注射了对照物幼体的β细胞（图3I）。接下来，作者将BefA注射到sox9b-/-幼体体内，发现β细胞显著增加（图3I），这表明它们对水流BefA的反应可能是通过血流介导的。

为了进一步研究血管系统的作用，作者使用造血发育异常且缺乏血管的块状突变体（图3J）。这些脆弱的突变体不能忍受GF的衍生，这限制了实验对象只能是CV幼体，即存在微生物的正常环境中的斑马鱼幼体。与CV WT型相比，CV突变体幼体的β细胞数量显著减少（图3K），而在水中添加高剂量的BefA并不足以完全挽救这种效应。然而，如果通过微灌胃将BefA传递给分段突变体，能够增加β细胞数量（图3K），这表明这些突变体能够通过HPD对BefA作出反应，但当肠道微生物群产生较少时却没有这一现象。总的来说，这些数据支持了分泌的BefA可以通过HPD或血管系统到达胰腺中遥远的β细胞的观点。研究结果还表明，BefA作用于β细胞时需要进入胰腺，进一步支持了它在体内直接作用的假说。肠道、HPD和血液代表了可能影响蛋白质折叠的截然不同的化学微环境。纯化的BefA具有较高的结构稳定性，在浓度超过20 mg/mL时可溶于无离子或缓冲液的水中，熔化温度约为68℃，与高度稳定的溶菌酶相当（图3L）。

图3. BefA直接与宿主β细胞相互作用

附图3. 追踪斑马鱼体内BefA的活性

4. BefA对宿主β细胞的直接活性在小鼠中是保守的

对编码SYLF蛋白的细菌基因组的分析（图S1C）表明，在新生儿β细胞发育过程中，哺乳动物的胰腺暴露于BefA同源物，同时存在微生物群定植（小编注：微生物群定植是指各种微生物经常从不同环境落到人体，并能在一定部位定居和不断生长、繁殖后代。而图S1C是细菌属SYLF同源物的亲缘树，分析了与BefA最接近的同源物与诱导宿主相关的基因表达。同系物按属分组，每个分支代表一个属内与BefA关系最密切的同系物。加粗的分类单元代表为比属更高的分类学级别。另外，图中根据在该分支中发现的成员所处环境进行标记：绿色=在水生宿主中发现的属，灰色=在水生环境中发现的属，黄色=在陆地宿主中发现的属，粉色=在人类宿主中发现的属，来自气单胞菌HM21和它的同系物气单胞菌ZOR0001SYLF原始BefA序列没有突出标记，只标注了是在人类宿主中发现的属的粉色箭头。这里想表达的是哺乳动物(不论是水生动物，陆生动物，或是人类)都存在微生物来源的BefA同系物，因为我们都暴露于微生物存在的环境中）。与斑马鱼一样，小鼠出生时就有完全分化的胰岛素分泌β细胞。在新生儿发育过程中，也就是在斑马鱼孵化后的时期，哺乳动物β细胞进行增殖以建立足够的合成胰岛素的组织。为了将BefA传递到小鼠肠道，作者设计了益生杆菌Nissle 1917（Nissle）菌株，表达来自染色体整合转基因（NisslebefA）的BefA。WT Nissle（NissleWT）本身不表达BefA基因，但BefA可在斑马鱼和小鼠中稳定定植，且非致病性。由于在其他大肠杆菌菌株中也发现了BefA同源物（图S1C），作者猜测Nissle可以产生和分泌功能性的BefA。

为了证实这一点，作者使用抗BefA抗体对细菌无细胞上清液（CFSs）进行了Western印迹检测（图S4A）。从WT A. veronii中浓缩的CFS具有预期大小的条带（29 kDa），而敲除befA的CFS没有条带，验证了抗befA抗体发挥了作用，Nissle可以产生和分泌功能性的BefA。同样，作者在含有NisslebefA CFS的电泳道上看到了一个强条带，而在含有NissleWT CFS的电泳道上没有（图S4A）。定植的NisslebefA GF幼体比NissleWT幼体数量明显多（图S4B），证实了GF分泌功能性的BefA。

接下来，在β细胞增殖水平达到峰值后（小编注：文中提到的是在新生小鼠出生12天或成年小鼠8周龄，细胞增殖达到峰值），作者检测了WT C57/BL6小鼠出生后的β细胞质量。由于产仔数的变化，这一幼年小鼠在体积上变化很大，这可能导致不同实验组的胰腺质量的差异（图S4C）。因此，作者量化了每只幼仔的胰岛素表达面积与胰腺总面积的平均比值。与GF或出生时就给予抗生素（ABXs）的小鼠相比，具有特定无病（SPF）微生物群的小鼠胰岛素阳性面积比例明显更高（图4A和4B），这表明常驻细菌在哺乳动物β细胞发育中发挥了作用。接下来，作者对Nissle菌株的GF幼崽进行单关联（MA）研究，发现NisslebefA定植组的胰岛素阳性面积明显高于NissleWT组（图4B和4C）。此外，还用ABX和纯化的BefA蛋白同时处理SPF幼崽，发现BefA处理足以将ABX处理的幼崽的总β细胞含量恢复到SPF水平（图4A和4B）。作者让一些Nissle MA长到成年。与幼崽一样，成年NisslebefA MA小鼠的β细胞质量明显高于NissleWT小鼠（图4D）。MA成年小鼠的胰腺总质量没有差异（图4E）。作者检测了成年GF和SPF小鼠的α细胞质量，没有发现显著差异（图S4D-S4F），这与在斑马鱼中的发现相似。总的来说，这些结果表明BefA能够增加小鼠的β细胞质量，并且这些作用是特异性的和持久的。

为了确定BefA是否直接作用于小鼠β细胞，作者将永生化的bTC-6细胞暴露于mCh或mCh-BefA99中。孵育后，清洗细胞，并通过免疫印迹法分析细胞膜、细胞质和冲洗液（PBS缓冲液+未结合的Befa）的组分。mChBefA99预期大小（45 kDa）的条带定位于所有bTC-6培养成分，包括细胞膜部分（图4F），而mCh（29kDa）的条带没有单独在细胞膜颗粒中发现（图4F）。与mNGBefA99蛋白共孵育的bTC-6培养成像显示斑点状标记（与mNG = 11共定位的细胞平均百分比，SD = 5），这与在斑马鱼细胞中的观察结果相似，而在单独给予mNG的细胞中没有斑点。（与mNG = 0.2共定位的细胞平均百分比，SD=0.6）（图4G）。与之前观察到的BefA与β细胞以外的斑马鱼细胞相互作用一致，作者还在培养的小鼠结肠细胞中观察到mNG-BefA99膜的积累和内化（图S4G；图 S1）。

作者接下来测试了BefA的SYLF结构域与小鼠胰岛的直接相互作用是否会增加β细胞的增殖。从新生SPF瑞士韦伯斯特小鼠中分离原代小鼠胰岛，在体外用mNG-BefA99、mNG、10 mM葡萄糖处理或不处理48小时，最后添加核苷酸类似物EdU来测量增殖。用mNG-BefA99处理的胰岛显示出明显的BefA99斑点，而用mNG处理的胰岛中没有（图4H）。与未处理组或mNG处理组相比，添加mNG-BefA99或葡萄糖导致EdU结合水平更高（图4I），表明BefA的SYLF结构域足以诱导小鼠胰岛细胞的直接增殖。

为了确定膜通透性是否足以产生这种反应，用Reg3a治疗原代新生小鼠胰岛，这导致了EdU掺入的显著剂量依赖性增加（图4J）。为了检测膜通透性是否对BefA介导的胰岛细胞转换（胰岛β细胞更新，即细胞增殖情况）有作用，作者用BefAR195A突变体处理原代新生小鼠胰岛。与WT BefA相比，BefAR195A导致EdU掺入水平显著降低（图4K）。综上所述，研究结果表明，BefA通过一种增加膜通透性的机制来诱导增殖。

最后，为了测试BefA是否可以通过其他解剖途径传播来引起体内β细胞的反应，作者将纯化的BefA蛋白腹腔注射到GF新生小鼠体内。用BefA处理的GF小鼠的胰岛素表达组织水平明显高于未处理的GF小鼠（图4L），表明腹腔内（i.p.）BefA的传递足以对胰腺产生与肠道细菌分泌时相同的作用。此前，已经发现GF幼体斑马鱼的循环葡萄糖水平升高，这表明β细胞质量的减少会降低胰岛素的生产能力。为了检测BefA治疗是否恢复了正常的代谢功能，作者测量了基础胰岛素分泌和血糖。注射了BefA的小鼠的血糖明显低于未经处理的小鼠（注射后多久检测？）（图4M），这与血清胰岛素水平的升高相一致（图4N）。总的来说，这些数据表明BefA能够诱导β细胞扩增，同时伴随胰岛素分泌增加和血糖降低。

图4. BefA对宿主β细胞的直接活性在小鼠中是保守的

附图4. BefA的活性在小鼠中是保守的

总结

动物微生物群分泌了大量未被探索的多种生物活性蛋白。BefA就是这样一个例子，它可以诱导胰腺β细胞的扩增。这种微生物产品的新颖性为揭示其生物活性机制提出了挑战。在这里，作者使用结构、遗传和生化方法来阐明BefA的作用机制。

BefA紧凑而稳定的结构可能赋予了它在不同的细胞外环境中生存的能力。研究发现，BefA可以在原代培养中直接诱导β细胞增殖，并且作者在体内通过多种给药途径对BefA的功能表征表明，它从肠腔和血液扩散到胰腺。缺乏明显的HPD或血管系统的幼体突变体的BefA抗性表明，这两种途径都参与了胰腺对BefA的反应。因此，来自肠道的微生物产物可以影响远端的宿主组织。

作者在简化合成脂质囊泡系统中的研究表明，BefA及其SYLF结构域具有固有的膜渗透活性。从病毒编码的病毒孔蛋白到动物AMPs，膜通透蛋白和多肽都普遍存在。许多细胞通过改变膜曲率发挥作用，在真核细胞膜上形成BefA斑点。另外，这些BefA斑点可能代表细胞修复BefA诱导的膜损伤的内吞或胞外反应，因此，BefA可以促进细胞膜的通透性，直接与β细胞发挥作用，促进其增殖，降低血糖，从而改善代谢状态。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cmet.2022.09.001

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