代谢学人

Cell Metabolism：巨噬细胞：棕色脂肪中的防“抑”先锋

在减肥道路上照亮前方的棕色脂肪组织（Brown adipose tissue，BAT）一直被认为与冷暴露期间的热量产生有关。在冷暴露条件下，线粒体氧化应激被激活上调。为应对氧化应激对线粒体代谢造成的损伤，需要由BAT介导线粒体的质量控制过程，即清除对脂肪细胞有害的线粒体碎片，提高线粒体的自我更新能力，从而维持线粒体的抗氧化应激与产热能力，常见的途径包括通过线粒体蛋白酶选择性降解线粒体成分或将氧化损伤的线粒体成分排出细胞外。例如，心脏（高代谢器官）可以通过产生和释放线粒体衍生囊泡 (Mitochondrial-derived vesicles，MDV，从线粒体中释放并含有一系列特定的货物蛋白) 来清除受损的线粒体组分，从而维持线粒体稳态。该途径由轻度氧化应激的产生诱导，通过生成MDV并选择性摄入受损线粒体碎片来清除特定的线粒体组分。近年来，在多种诱导线粒体损伤的生理环境中也观察到了将受损的线粒体组分包装进入细胞外囊泡 (Extracellular vesicles,EVs) 或迁移小体 (Migrasome)（小编注：迁移小体是一种膜性细胞器，其大小大约在0.5 μm到3μm之间，膜泡内还包含着数量不等的直径在纳米级别的小囊泡。迁移体通过细胞的迁移运动产生，可作为一种新的方式向胞外释放胞质成分）中从而排出。

有研究表明，巨噬细胞可以主动吸收并清除细胞外线粒体。众所周知，巨噬细胞在调控脂肪组织稳态中起着重要的作用。以往的研究多集中在白色脂肪组织（White adipose tissue, WAT）中的巨噬细胞，其可以通过促进脂肪细胞对葡萄糖的利用、调节脂质储存和释放以及通过调节白色脂肪组织交感神经张力，从而增加能量消耗而调节机体的代谢稳态。或者，在肥胖的背景下，多种细胞因子激活WAT中的巨噬细胞，从而促进慢性炎症，导致糖、脂和能量代谢紊乱。那么脂肪组织中的巨噬细胞能否参与主动吸收细胞外线粒体呢？近期有研究表明，在正常人群中，从脂肪组织到巨噬细胞的线粒体转移是调节机体代谢稳态、维持能量平衡的重要机制，这一过程在肥胖患者中受到损害，从而加剧了肥胖患者的能量稳态异常。当小鼠脂肪组织中受损的线粒体组分向巨噬细胞转移途径被抑制后，小鼠表现出较低的能量消耗。不仅如此，研究表明，当巨噬细胞耗竭或敲除巨噬细胞中硫酸乙酰肝素合成基因Ext1时（抑制巨噬细胞摄取胞外线粒体过程），皮下脂肪的棕色化程度与产热能力也出现了显著下调。但目前为止，巨噬细胞-脂肪细胞通过何种方式进行线粒体转移仍不清楚。此外，该过程是否发生在 BAT 中或调节适应性产热也有待研究。

近期发表在Cell Metabolism上的一篇题目为“Ejection of damagedmitochondria and their removal by macrophages ensure efficient thermogenesis inbrown adipose tissue”对这些问题进行了研究，发现产热应激的棕色脂肪细胞会释放含有氧化损伤线粒体组分的细胞外囊泡（EVs），这些囊泡可以被巨噬细胞摄入并清除，从而维持产热程序的正常进行。

棕色脂肪细胞具有高代谢活性，在冷暴露期间能承受高强度的线粒体应激，这便要求这些细胞具有高效的线粒体自我更新能力。为了全面了解 BAT 的线粒体动力学，作者利用数据库对肩胛间 BAT（具有最高产热能力）和内脏 WAT（具有最低产热能力）之间的差异表达基因进行分析。通过对重叠基因的功能富集分析，结果显示，这些基因与线粒体、线粒体内膜和细胞外泌体小室有关（图1A和1B）。作者假设含有线粒体蛋白的EVs是BAT生物学中特殊的功能元件，于是检测了囊泡中含有的线粒体的组分及其从棕色脂肪细胞中的释放情况。对从BAT和T37i棕色脂肪细胞（T37i细胞系是衍生自小鼠休眠瘤(Hibernoma)的棕色前脂肪细胞系）（小编注：Hibernoma是一种罕见的含有棕色脂肪的良性软组织肿瘤。临床上，它们表现为生长缓慢、无痛的软组织肿块。与其他脂肪肿瘤不同，它们含有丰富的线粒体并且具有高度的代谢活性。）收集的EVs进行MitoTracker Green (MTG)染色结果呈阳性（图1C）。基于产热过程中BAT重组线粒体腔室（小编注：作者这里指的是在BAT中维持高产热作用所需要的对线粒体形态的调控和自我更新，即通过线粒体质量控制维持线粒体功能。写成线粒体腔室重组是因为在经过线粒体形态改变后其折叠结构都会出现变化，但其本质仍为线粒体形态变化与质量控制。这些质量控制常见的几种方法在本文和本公众号发表的往期精读中均有详解。）的能力，作者探究冷暴露状态下，线粒体通过EVs释放物质的能力变化情况。对冷暴露小鼠（4℃，20小时）的BAT进行功能富集分析表明上调的基因与细胞外外泌体和线粒体有关（图1D）。同时，BAT的EVs的蛋白质组分分析也显示，在已鉴定的1779种蛋白质中，近50%属于细胞外外泌体和线粒体的成分（图1E和S1A）。通过将BAT 中EVs的蛋白质组与线粒体蛋白(GO:0005739)和MitoCarta 3.0数据（包括人和小鼠的线粒体蛋白和通路的数据）进行比较，发现有148个重叠蛋白（图 1F），进一步利用Vesiclepedia数据库（一个EVs分子数据（脂质、RNA和蛋白质）的手工检索数据库）则鉴定出134个重叠的EV-cargo蛋白（即EV包裹并运送的蛋白）（图 1G）。对最具代表性的前100种全蛋白质（图1H）和上调蛋白质（图1I）的分析显示， 4℃ BAT 的EVs中线粒体成分和代谢相关过程明显富集。值得注意的是，4°C BAT的EVs中鉴定的蛋白质主要来自棕色脂肪细胞（图1I）。

为了验证蛋白质组学分析的结果，作者选择丙酮酸脱氢酶E1亚基 β（pyruvate dehydrogenase E1 subunit β，PDHβ，它是BAT的EVs和棕色脂肪细胞中最具代表性的蛋白质之一）进行实验验证（图S1B）。尽管在4°C与30°C条件下BAT匀浆中PDHβ水平没有差异（小编注：若EVs不能发挥打包并排出受损线粒体时，4°C下PDHβ应高于30°C。但在本实验中无明显差异，说明EVs发挥将冷刺激下大量PDHβ打包排出的作用），但在4°C BAT的EVs中PDHβ水平升高（图 1J）。此外，在EVs中未检测到UCP1，但冷暴露后BAT匀浆中的UCP1显著增加（图1J)。在使用β3-肾上腺素受体激动剂CL316,243(CL)刺激的原代细胞(pBAs)和T37i棕色脂肪细胞分离的EVs中检测到了同样的富集（图1K和S1C）。为了探究棕色脂肪细胞线粒体代谢活性的增加是否是线粒体蛋白释放的触发因素，作者分别分离了脂生成前后以及在抑制脂肪细胞产热潜力后的EVs。结果发现，与未分化的 T37i 细胞相比，分化的脂肪细胞释放出的PDHβ水平更高，H89（可以抑制蛋白激酶 A (PKA) 信号传导）处理则减少了通过 EV 释放的 PDHβ（图1L）。靶向代谢组学显示三羧酸（ tricarboxylic acid，TCA）循环的代谢物存在于 BAT的EVs中，而在4°C下减少（图S1 D）。相比之下，4°C下BAT的EVs 中的 AMP、ATP 和 mtDNA 水平高于在30°C 条件下BAT的EVs（图 1M 和 1N）。说明棕色脂肪细胞线粒体代谢活性的增加能够促进线粒体蛋白的释放。(小编注：在TCA循环中，PDHβ（位于线粒体内膜）将丙酮酸转化为乙酰CoA从而参与TCA循环，其含量与TCA循环通量呈正相关。作者在这里检测PDHβ含量后，发现脂肪细胞中TCA循环的中间产物也出现下调，从而验证部分PDHβ被释放进入EVs。由此可以得到线粒体代谢活性的上调可以引起部分线粒体组分被释放进入EVs）

图1. BAT通过EVs释放线粒体组分

通过动态光散射(Dynamic light scattering, DLS)测量EVs直径，作者发现两个大小约为350nm和50nm的主要群体（图S1E），它们可能分别代表微囊泡和外泌体。使用0.22-μm孔径的过滤器过滤EVs，并检测对照组和CL处理组的棕色脂肪细胞释放的EVs中PDHβ和丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase, PC)（图S1F），提示细胞外线粒体主要存在于EVs的最大组分中，而非在外泌体中。为了证实这一点，作者通过GW4869（一种非竞争性的外泌体合成/释放抑制剂）或下调参与外泌体的生物发生的中性鞘磷脂酶2(Neutral sphingomyelinase 2, nSMase2, SMPD3)来抑制外泌体的生物发生，发现EVs中PDHβ和PC的蛋白水平增加（图S1C）。通过顺序离心获得不同EVs组分的分析显示，PC和PDHβ仅在最大的组分中检测到（图S1G）。

图S1. BAT和成熟的棕色脂肪细胞释放的EVs含有线粒体蛋白

已有研究表明，代谢应激下的白色脂肪细胞可以通过EVs释放受损的线粒体蛋白。那么，由冷暴露引起的代谢应激产生的线粒体损伤是否会促使线粒体蛋白释放到EVs中？为了证明这一点，作者接下来使用线粒体应激药物处理pBAs细胞，即CL（冷暴露模拟药物）或低剂量的FCCP(Carbonylcyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone, 三氟甲氧基羰基氰苯腙，可以通过诱导非耦合呼吸引起线粒体损伤（小编注：这些物质通过破坏线粒体内膜，并引起线粒体去极化，形成质子漏，从而增加耗氧程度但不影响细胞磷酸化，降低ATP生成）而不导致脂肪细胞死亡)。蛋白质组学分析显示EVs蛋白质组与其来源的棕色脂肪细胞之间存在独特的蛋白质聚类（图2A和2B）。使用MitoCarta 3.0软件对CL或FCCP处理后的EVs和棕色脂肪细胞中过表达的线粒体蛋白进行分析后，发现在用CL或FCCP处理后，有63种线粒体蛋白在EVs中选择性过表达（图2C和2D）。此外，在经FCCP处理的T37i释放的EVs中，也检测到在pBAs的EVs中的几种线粒体蛋白的表达（图2E）。值得注意的是，使用异丙肾上腺素或另一种选择性线粒体应激物（抗霉素A）处理的pBAs表现出EVs的线粒体蛋白增加，这一结果也证实了蛋白质组数据的正确性(图2F和2G)。说明线粒体损伤后会将线粒体蛋白释放到EVs中。

透射电镜(Transmission electron microscopy, TEM)结果显示，4°C下BAT的线粒体发育出包含线粒体内外膜的“萌芽”（图2H）。这些超微结构特征让人想起MDVs，MDVs在线粒体中发育并包含一系列特定的载物蛋白（如PDH或TOM复合物）。为了追踪MDVs，作者将携带PDHβ-GFP的慢病毒颗粒转导的永生化小鼠原代棕色脂肪细胞(iBPA_m)进行共聚焦显微分析。在经过CL处理后，PDHβ-GFP+水平升高，PDHβ和TOMM20 (PDHβ+/TOMM20-)之间的共定位程度显著降低(图2I)。为了验证PDHβ是否被包装到了TOM复合物阴性的MDVs里，作者将其进行分离。结果显示在活化的BAT中观察到PDHβ和PC水平升高（图S1H）。值得注意的是，在基础条件下已经在MDVs中观察到PDHβ，其含量在产热诱导时增加并在产热抑制时减少（图2J和2K）。由于线粒体蛋白的选择性吸收，在MDVs中未检测到UCP1。文献报道表明，MDVs是一种线粒体质量控制系统的一部分，其向EVs提供线粒体组分。与这些报道一致的是（图2H和2L）。说明BAT中EVs的生成可能与MDVs生成有关，即通过MDVs向EVs提供线粒体成分从而达到维持线粒体形态与功能的目的。（小编注：之前已有大量文献证明， MDV 是向 EV 提供线粒体成分的替代线粒体质量控制系统的一部分，含有线粒体碎片的MDVs可以通过进入溶酶体被降解或形成微囊泡排出体外，且该过程依赖于分选连接蛋白Snx9）

有研究发现，PINK1(PTEN-induced kinase 1， PTEN诱导的激酶1)通过活性氧(ROS)依赖性和线粒体自噬非依赖性机制调控PDH+/TOMM20-MDV的产生。作者发现产热刺激可导致PINK1水平升高（图S1I和S1J），而下调PINK1表达，发现在MDVs和EVs中PDHβ和PC的释放减少（图2M）。作者又通过检测4-HNE（4-hydroxynonenal，一种氧化/亚硝化应激生物标志物）蛋白复合物的形成，发现线粒体中蛋白质氧化水平升高（图S1K）。有趣的是，线粒体分裂的主要调节因子DRP1(Dynamin-related protein-1, 线粒体动力相关蛋白)的下调并不影响EVs中PC的蛋白水平（图S1L），因此可以排除PC参与EVs释放过程这一可能性。文献报道MDVs可以靶向溶酶体降解或通过EVs释放。氯喹(Chloroquine, CQ)通过抑制溶酶体降解增加了棕色脂肪细胞EVs中PDHβ和PC的蛋白水平（图2N)，这说明线粒体应激条件下PINK1介导的MDVs和EVs的形成是清除受损线粒体蛋白和确保线粒体稳态的另一种机制。

在生理条件下，棕色脂肪细胞产生线粒体ROS( mitochondrial ROS，mtROS)以维持产热。因此，作者假设棕色脂肪细胞通过MDVs将氧化损伤的线粒体蛋白导入EVs中。通过检测MDVs和EVs中PDHβ的半胱氨酸氧化水平，发现EVs中的氧化率高于MDVs（图2O）。在CL处理后进一步积累的EVs中则观察到其他形式的蛋白质氧化（4-HNE和羰基蛋白加合物形成）（图2P）（图S1M）。为了进一步说明氧化应激和线粒体蛋白种类的关系，作者使用了N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine , NAC)，它可以有效限制线粒体、MDVs和EVs的氧化损伤（图2Q-S和S1N）。NAC还能够在CL处理的棕色脂肪细胞中抑制线粒体蛋白进入MDVs和EVs（图2T）。此外，通过SOD2过表达可以更准确地限制mtROS的产生，减少PDHβ的释放（图2U）。这说明EVs是一个高度氧化损伤的结构，在细胞氧化应激条件下释放，抗氧化剂处理则能够减少。

拓展阅读

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图2. 棕色脂肪细胞通过MDVs/PINK1依赖性机制释放氧化的线粒体蛋白

图S2. BAT EVs影响棕色脂肪细胞的产热电位

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