编译：朱海珍，编辑：小菌菌、江舜尧。

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本研究从位于中国西南地区的重庆市、四川省、云南省及广西壮族自治区各选择了两个喀斯特洞穴进行采样，采样洞穴的地理位置见附图1。各个采样洞穴的主要地质化学特征见表1。每个洞穴自洞口起每隔200米设置一个采样点，由于洞穴长度不同，每个洞穴设置3-5个采样点不等，每个采样点分别采集空气、岩石、沉积物和水样。对采集的洞穴样品提取总DNA，进行16S rRNA基因V4区扩增子测序。

附图1 采样洞穴在中国西南地区的地理位置分布

表1 采样洞穴的主要地化学特征

测序数据的质控、去重、去除单条序列及OTU聚类使用USEARCH软件，质控参数为”fastq_maxee=0.5”，OTU聚类标准为相似性97%。OTU注释使用SILVA数据库，生成OTU表后过滤平均相对丰度小于0.00001的OTUs，并进一步过滤注释为线粒体和叶绿体的OTUs。

数据的统计分析及可视化主要使用R及其工具包实现。数据的正态性通过Shapiro-Wilk test进行检验，方差的均质性通过Bartlett’s test进行检验。对于符合正态分布且方差齐的数据，使用方差分析 (ANOVA) 探究不同组别的差异显著性，若差异显著，使用Tukey’s HSD进行事后检验。对于不符合正态分布或方差非均质的数据，使用Kruskal-Wallis秩和检验探究不同组别的差异显著性，若差异显著，使用Dunn’s test进行事后检验。

主坐标分析使用Weighted UniFrac矩阵和Bray-Curtis距离矩阵进行计算，通过蒙特卡洛置换检验 (PERMANOVA) 检验差异的显著性。α多样性指数与环境因子之间的显著性使用斯皮尔曼相关性指数衡量。为降低共现网络的复杂性，仅选择在整个数据集或在每种类型样品中平均相对丰度大于0.05%的属用于网络构建。两个属之间的斯皮尔曼相关性指数大于0.6且p值小于0.01时，认为两者之间存在强的相关关系。

1 洞穴细菌的群落组成

质控并去除线粒体和叶绿体DNA序列后，共获得4,772,351条16SrRNA基因序列（V4区）。每个样品获得的序列数为24,093到51,945条，平均每个样品37,683条。按照相似性97%的阈值，这些序列聚类成11,444个OTUs，其中97.8%被注释为细菌。变形菌门、放线菌门和厚壁菌门是洞穴细菌群落的主要类群（平均相对丰度大于10%），共占整个群落的89.1%（图1）。其中，变形菌门（平均相对丰度41.1%）主要是γ变形菌纲（平均相对丰度32.4%）和α变形菌纲（平均相对丰度7.9%）。另外两个主要的门，放线菌门（37.6%）和厚壁菌门（10.4%），占优势的分别是放线菌纲（25.2%）和芽孢菌纲（9.6%）。另外，古菌中的奇古菌门（Thaumarchaeota），细菌中的芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）和拟杆菌门，在洞穴群落中的平均相对丰度都大于1%。在更细的分类水平上，21个科水平的分类单元平均相对丰度超过了1%，其中假诺卡氏菌科（Pseudonocardiaceae）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）丰度格外高。

图1 整个数据集在门水平的平均相对丰度(A)及各个洞穴的细菌群落中主要门类的平均相对丰度 (B)

2 洞穴细菌的多样性及分布特征

洞穴细菌群落的α多样性使用香农指数和Chao1指数进行评估。8个洞穴的细菌群落α多样性没有显著差异（Shannon: ANOVA, p > 0.05; Chao1: Kruskal-Wallis test, p > 0.05）。然而，沉积物和水样的Chao1指数显著高于岩石和空气样品（Kruskal-Wallis test, Dunn’s test, p < 0.05）。香农指数同样证实了沉积物样品的α多样性显著高于岩石和空气样品，但水样与其它三种类型的样品之间没有显著差异（表2）。

表2 不同类型洞穴样品细菌的α多样性指数

主坐标分析表明，洞穴样品中的细菌群落按照样品类型聚集成簇（图2）。空气样品紧密地聚集成一簇，并且与其它类型的样品明显区分。水样的分布比较稀疏，与其它三种类型的样品有不同程度的重叠。这一结果表明，作为细菌群落生存的基质，洞穴样品的类型对细菌群落的多样性有重要的影响。由于不同类型的洞穴样品其营养条件不同，这一结果也是合理的。另外，作为细菌的生长基质，不同类型的样品也代表了不同的营养条件：岩石是来自于洞穴本身，只有少量由渗漏水带入的外界营养物质；沉积物是由流水从外界带入洞穴并滞留在洞穴中的；水样和空气由于具有流动性，能够相对更自由和频繁地与外界环境进行物质交换。

图2 基于Weighted UniFrac矩阵的主坐标分析。虚线表示95%置信区间

为了探究影响洞穴细菌群落多样性的因素，计算了洞穴采样点的环境因子与α多样性的斯皮尔曼相关性，并将其与β多样性的距离矩阵进行了拟合（表3）。从整个数据集来看，温度和空气湿度显著地影响细菌群落的β多样性，但是与α多样性没有显著的相关性。但是，如果单独评估这些环境因子对每种类型的洞穴样品中细菌多样性的影响时，可以得到如下三条结论：（1）对于空气样品来说，湿度与香农指数呈显著的负相关关系，温度和湿度均显著地影响细菌的群落结构；（2）对于岩石和水样来说，所有评估的这些因子与香农指数都没有显著的相关关系，但是总有机碳显著影响细菌群落的β多样性；（3）对于沉积物样品来说，温度、空气湿度、总有机碳、总氮及含水量均显著地影响细菌的群落结构，含水量与香农指数呈显著的正相关关系，总氮与香农指数呈显著的负相关关系。

表3 环境因子对洞穴细菌多样性的影响

3 不同类型洞穴样品的细菌群落差异

在水样和空气样品中，变形菌门是丰度最高的门，分别占47.9%和50.5%；在沉积物和岩石样品中，放线菌门是丰度最高的门，分别占42.1%和55.4%（图3A）。与其它三种类型的样品相比，厚壁菌门在空气样品中的丰度非常高（25.3%）。从纲水平上分析变形菌在各种类型洞穴样品中的分布，γ变形菌在空气和水样中占绝大多数，分别为44.9%和39.6%；与空气和岩石样品相比，δ变形菌在水样和沉积物样品中的丰度更高；与其它类型的样品相比，沉积物样品中的α变形菌更丰富。

韦恩图表明，在四种不同类型的样品中，细菌的OTUs分布也是不同的（图3B）。与主坐标分析的聚类情况一致，聚类最紧密的空气样品中的特异性OTUs数量最多，而聚类最稀疏的水样中的特异性OTUs数量最少。四种类型的样品中共有的OTUs数量为6,816个。尽管一半以上的OTUs在四种类型的样品中都存在，把β多样性拆分为成分多度及物种转换后，物种转换的影响仍然在β多样性中占绝大部分。

图3 洞穴细菌在门/纲水平 (A) 及OTUs水平的分布情况 (B)

对洞穴系统中空气样品的研究较少，但洞穴空气中的细菌群落十分独特，与另外三种研究更为普遍的样品类型有显著差异（PERMANOVA, p < 0.01）。为了更好地理解洞穴空气细菌群落的独特性，将空气样品中的OTUs与其它三种类型的样品进行了比较（图4）。大多数柔膜菌门（Tenericutes）、拟杆菌门、厚壁菌门和蓝细菌门（Cyanobacteria）的OTUs在空气样品中得到显著的富集；变形菌门和放线菌门的部分OTUs在空气样品中显著富集，而另一部分显著减少；酸杆菌门及其它门类的OTUs在空气样品中显著减少。

图4 洞穴中空气样品与其它三种样品中细菌OTUs的比较。CPM表示物种的丰度，虚线表示95%置信区间，向上的实心三角表示在空气样品中显著富集的OTUs，向下的空心三角表示在空气样品中显著减少的OTUs，实心圆点表示没有显著差异的OTUs，三角和圆点的大小反应该OTU的丰度

通过指示物种分析（IndVal analysis），在不同类型洞穴样品的细菌群落中共检测到17个可作为样品类型特异性指示类群的属（图5）。与韦恩图展示的样品类型特异性物种的趋势一样，水样没有检测到可以作为指示物种的类群，而空气样品检测到的指示类群最多，为8个。岩石样品和沉积物样品在PCoA图上有一定程度的重叠，它们的细菌物种组成在门水平上也比较相似，但是仍然分别检测到5个和4个指示类群来反映其生态位的特殊性。从物种上来看，所有岩石样品中的指示类群都属于放线菌门，空气样品中一半的指示类群属于γ变形菌纲。

图5 不同类型洞穴样品中的细菌指示类群（属）。指示值 > 0.6, p < 0.05的属水平分类单元认为是指示类群

4 洞穴细菌群落的共现网络

洞穴细菌共现网络包含150个节点（属水平分类单元），399条边（图6）。为了描述节点之间复杂的相互关系，计算了网络的拓扑特征：平均路径长度（average path length, APL）为2.856，网络直径（network diameter, ND）为8，聚类系数（clustering coefficient, CC）为0.107，模块化指数（modularity index, MD）为0.549。网络中的节点属于12个门，其中属于变形菌门、放线菌门、厚壁菌门的节点最多，占所有节点的83%。基于介数中心度（betweenness centrality, BC），网络中最重要的三个节点为硝化螺菌科（Nitrosococcaceae）的wb1-P19，罗库菌目（Rokubacteriales）的一个未培养类群和盖亚菌目（Gaiellales）的一个未培养类群。

图6 基于相关性的洞穴细菌共现网络。图A中的节点按照分类着色，图B中的节点按照模块着色，节点的大小代表介数中心度，边的粗细代表该相关性的权重

模块是网络中紧密相关的一个区域，其内部的相关关系比外部更多。在洞穴细菌共现网络中，大部分节点落在4个主要模块中，而每个模块中的节点呈现出一定的样品类型偏好性。例如，模块1中的大部分节点在空气样品中更丰富，模块4中的大部分节点在沉积物样品中的丰度更高，模块3中的节点主要在岩石和沉积物样品中丰度较高，而模块6中的节点主要在水样中的丰度较高。这意味着洞穴细菌群落在每种类型样品内部的联系比在不同类型样品之间的联系更为密切。

为了进一步探究每种类型洞穴样品中的细菌共现模式，为每种类型样品中的细菌群落单独构建了共现网络，并计算了每个网络的拓扑特征（表4）。水样共现网络的节点及边的数量、聚类系数及平均度（average degree）都是4个网络中最高的，表明水样中的细菌存在最广泛的相关关系。空气样品共现网络的节点及边的数量最少，平均路径长度也是最低的，表明空气样品中的细菌虽然相关关系最少，但这些相关关系更为紧密。平均路径长度较小的网络被认为具备“小世界（small world）”属性，能够快速响应生态系统的波动。这预示着洞穴空气中的细菌群落可能存在一个小的核心类群，对环境变化具备较强的抵抗力。

表4 不同类型洞穴样品中细菌共现网络的拓扑特征

本研究对中国西南地区八个喀斯特洞穴的细菌群落进行了评估，极大地丰富了对原始寡营养洞穴微生物的系统认识，检测到的多种多样的细菌类群也将进一步推动对洞穴微生物参与的生物地化学循环的研究。在洞穴细菌群落中，丰度最高的是变形菌门、放线菌门和厚壁菌门。从纲水平来看，丰度较高的是γ-变形菌纲、放线菌纲、芽孢菌纲等。α多样性分析表明，沉积物样品中的物种丰富度显著高于岩石和空气样品，环境因子对不同类型样品中细菌群落α多样性的影响也不尽相同。主坐标分析表明，洞穴细菌群落主要按照样品类型聚类，来自空气、岩石、沉积物和水样中的细菌群落组成存在显著差异。变形菌门在水样和空气样品中占优势，而放线菌门在沉积物和岩石样品中占优势，岩石、沉积物和空气样品中均能检测到可作为生物标记物的指示类群。空气样品中的细菌群落与其它三种样品中的细菌群落差异最为显著，存在显著富集或缺失的OTUs。通过细菌共现网络分析，确定洞穴细菌群落中的关键类群包括硝化螺菌科的wb1-P19、罗库菌目的一个未培养类群和盖亚菌目的一个未培养类群。不同类型样品中的细菌共现网络存在不同的拓扑特征，洞穴细菌在每种类型的样品内部的相互联系比不同类型的样品之间更为密切。

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