原名：Transcription response of Tetranychus cinnabarinus toplant-mediated short-term and long -term selenium treatment

译名：棉花红蜘蛛（Tetranychus cinnabarinus）对植物介导的短期和长期硒处理的转录响应

期刊：Chemosphere

IF：5.778

发表时间：2020.8

通讯作者：何林

通讯作者单位：西南大学植物保护学院（College of Plant Protection, Southwest University）

测定的棉花红蜘蛛（T. cinnabarinus）菌落最初于1997年从重庆种植的豇豆幼苗中采集的，此后一直在室内饲养。在温度为26 ± 1℃，相对湿度为65 ± 10%，光照周期为14：10h（L：D）的培养箱中饲养豇豆幼苗。为确定亚硒酸钠的处理浓度，分别采用0、200、500和1000 μM 4个浓度检测蜘蛛螨的死亡率。根据实验结果，本研究最终选择了4个亚硒酸钠浓度（5、20、50和200 μM）和两个空白对照来处理蜘蛛螨。在短期处理中，采用叶盘法用亚硒酸钠处理蜘蛛螨2 d；在长期处理中，在豇豆幼苗上用亚硒酸钠处理蜘蛛螨30 d。每个处理三个生物学重复。所有样本采集后对对RNA进行提取，并用于后续生物学分析。

1 亚硒酸钠处理浓度的筛查

四种浓度的亚硒酸钠处理蜘蛛螨48 h后，不同处理组蜘蛛螨的死亡率与对照组之间未表现出显著差异。处理72 h后，蜘蛛螨开始死亡（图1）。基于此，我们将短期处理时间设定为2 d，短期转录组测序条件设定为亚硒酸钠浓度不超过200 μM。在初始阶段，蜘蛛螨种群发展缓慢，到30 d时种群增长基本恢复，因此长期处理时间设定为30 d，浓度与短期浓度相同。

图1 筛选亚硒酸钠处理蜘蛛螨的浓度和时间。不同的小写字母代表了组间具有显著性差异。

2 转录组测序和功能注释

通过对从两个空白对照（S-CK、L-CK）以及两个时间段、四个亚硒酸钠浓度下构建的30个独立cDNA文库进行测序，我们发现每个文库至少产生20,504,101个reads。数据质量评估显示，Q30比率>94%，GC计数在38%至40%之间（表1）。30个文库共组装成14,753个基因。基于Nr数据库比对，共14,583个基因可以被Tetranychus urticae基因组注释。其余170个可由其他种注释（E<10⁵）（图2A）。基于Blast2GO程序进行GO分析，并对基因进行功能分类。总共7730个基因被分为三个主要的GO类别，并进一步分为52个亚类（图2B）。此外，10,119个基因被注释到KOG数据库的25个类别（图2C）。

表1 对照组和亚硒酸钠处理样品的转录组测序数据概述。

图2 转录组数据的功能注释。A-C分别代表Nr数据库（A），GO数据库（B）以及KOG数据库（C）。

3 差异表达基因（DEGs）的识别及分析

采用DESeq法在空白对照组和各处理组的比较中鉴定DEGs（FDR < 0.01，fold change ≥ 2）（图3）。为了证实不同生物重复之间的重复性以及不同浓度亚硒酸钠处理对基因表达的影响，我们对DEGs的表达水平进行了主成分分析（PCA）。无论是短期亚硒酸钠处理还是长期亚硒酸钠处理，相同浓度处理间的生物重复都能较好地聚集，且不同浓度之间存在明显的差异（图4）。这一结果表明，不同生物重复间具有良好的重复性，不同亚硒酸钠处理对基因表达有不同的影响。

图3 不同组别之间DEGs的火山图分析。

图4 短期（A）和长期（B）处理组中不同表达基因的PCA分析。

不同处理组的DEGs数量从101到470不等（图5）。无论是短期处理还是长期处理，20 μM亚硒酸钠浓度下的基因差异最大，说明蜘蛛螨对20 μM亚硒酸钠的响应最强。大多数处理组下调的DEGs多于上调的DEGs（图5C）。4个短期处理共享了38个差异表达基因，而4个长期处理共享了42个差异表达基因（图5A和B）。

图5 短期和长期处理组中差异基因数量的统计学及Venn图分析。A-B分别代表短期（A）以及长期（B）处理下差异基因的Venn图分析；（C）代表不同时间和不同浓度亚硒酸钠下不同基因数量的统计学分析。

4 DEGs的功能注释

在8个数据库中对这些基因进行了功能注释，结果显示匹配基因的数量分布在101到470之间（表2）。基于GO数据库注释，我们发现不同处理组DEGs的注释结果略有不同。这其中基因富集差异最大的四个类群分别是“代谢过程”、“催化活性”、“单一生物过程”和“结合”。这些结果表明，从GO分类的角度来看，不同时间、不同浓度的亚硒酸钠处理对蜘蛛螨的影响具有相似性。基于KOG数据库对DEGs的功能进行预测和分类，我们发现，在所有处理组中，DEGs主要富集在四个簇中：“信号转导机制”、“一般功能预测”、“翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣”和“碳水化合物运输和代谢”。然而，不同的处理组之间仅表现出轻微的差异。对前20个KEGG途径的分析表明，DEGs主要富集于“溶酶体”、“细胞色素P450代谢外源性物质”和“药物代谢-细胞色素P450”途径（图6和图7）。说明硒处理对蜘蛛螨体内有毒物质的转运和解毒有显著影响。

表2 8个数据库中不同表达基因的功能注释结果。

图6 短期处理组DEGs的KEGG途径分析。A-D分别代表5、20、50、200 μM浓度下硒的短期处理。

图7 长期处理组DEGs的KEGG途径分析。A-D分别代表5、20、50、200 μM浓度下硒的长期处理。

在8个处理组中有25个差异表达基因，包括8个上调表达基因和17个下调表达基因（表3和图8）。这表明，在不同浓度和不同时间条件下，蜘蛛螨对亚硒酸钠的响应机制相似。基于基因功能注释，我们发现，4个P450基因在所有处理组中均表达下调，这表明亚硒酸钠可降低蜘蛛螨的解毒功能。几丁质酶基因表达上调表明亚硒酸钠处理可能影响蜘蛛螨几丁质代谢和表皮形成。MAP激酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶表达上调，表明亚硒酸钠可以调节细胞生长、周期、分化、有丝分裂和凋亡。

表3 8个处理组中差异表达基因列表

图8 以热图的形式分析了8个不同处理组中不同表达基因。

硒通常以亚硒酸盐的形式存在，并通过植物吸收转移到高等动物体内。通过植物培养基探究硒对蜘蛛螨的影响具有合理性。本研究以植物介导的亚硒酸钠处理取代传统的直接用硒处理昆虫的方法。研究的第一步是确定亚硒酸钠处理浓度和试验持续时间。我们使用的最高浓度在短时间内不会导致蜘蛛螨死亡。我们确定200μM处理2 d为最高处理浓度，并设置三个较低浓度（50、20和5 μM）进行梯度处理。以确定长期和短期硒处理对蜘蛛螨的影响是否具有差异性，此外我们还设置了相同浓度的长期硒处理。

转录组测序结果和注释的分析支持测序结果的可靠性。对差异表达基因的PCA分析表明，蜘蛛螨对不同浓度亚硒酸钠处理的响应机制有很大差异。无论是长期还是短期处理，蜘蛛螨对20 μM硒的响应最大。这可能是因为豇豆的富硒能力在20 μM时达到最大值。高浓度硒会影响豇豆对蜘蛛螨的抵抗响应。在数量上，蜘蛛螨对硒的瞬时响应基因略多于长期适应基因。然而，这些共享差异基因存在于长期处理中而非短期处理，这可能是因为在蜘蛛螨对硒的适应过程中，基因表达逐渐稳定。

功能注释结果表明，在短期和长期亚硒酸钠处理下，蜘蛛螨的DEGs分类具有相似性。其原因可能是30 d的处理时间不足以完全适应蜘蛛螨，也可能是30 d的处理时间仍处于应激响应阶段。但差异基因的数量趋于稳定，这也证明了叶螨可能逐渐开始适应硒胁迫。例如，蜘蛛螨对杀螨剂的抗性一般需要10代以上的选择，而适应新寄主一般需要20代以上。因此，本研究只能揭示叶螨对硒处理的应激响应机制，而不能探讨其长期适应机制。

许多P450基因在响应基因的挖掘过程中表达下调，提示硒处理可以降低蜘蛛P450基因的表达。这一结果与家蚕的研究具有矛盾性，但与其他物种的研究一致。这可能是由于不同生物体对硒的耐受性不同所致。例如，低浓度硒诱导P450基因表达上调，高浓度硒抑制P450基因表达。P450s是一类代谢解毒酶，在蜘蛛螨对杀螨剂的抗性及其对新寄主的适应中起重要作用。在今后的研究中，我们可以利用硒抑制P450基因表达的能力来增强化学杀螨剂的活性。

几丁质酶的功能是催化几丁质中β(1e4)键的随机水解。几丁质酶的表达上调表明，硒处理后，蜘蛛螨对几丁质的降解增加。这一特性可用于提高某些接触杀螨剂的活性。其他差异表达基因的功能及其在硒反应中的作用有待进一步研究。

本研究采用植物介导的硒处理方法。因此，除了对硒的直接反应外，蜘蛛螨的响应基因在某种程度上具有植物响应性。许多研究表明，硒可以增强作物对害虫的抗性，例如通过刺激植物抗性因子茉莉酸的合成。硒处理可以增强植物的防御响应，进而改变蜘蛛螨对植物的反应。因此，这些差异基因必须从两个方面进行分类：一是基因对硒的直接响应，二是基因对植物防御反应的响应。但本研究的目的并不是为了区分这些基因。

综上所述，我们采用植物介导的硒处理方法，在不同浓度梯度下分析了蜘蛛螨类对短期和长期硒暴露的响应基因。研究结果揭示了蜘蛛螨对硒的响应机制，并发现了一些关键基因，这些基因可能有助于开发新的蜘蛛螨防治策略。在未来的研究中，可以利用基因信息进一步探索蜘蛛螨对硒和硒介导的植物防御的反应机制。