编译：微科盟莫沉，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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1 粪便蓝色染料法作为一种低廉方法用于评估大基数人群肠道传输时间

本研究中，肠道传输时间是指从标准松饼内摄入蓝色染料到粪便内第一次出现可见蓝色的排泄物的持续时间(图1A)。该方法操作简单且成本低廉(每人一份松饼大约1美元)，参与者的耐受性好。

整个研究队列中受试者的中位肠道传输时间约为28.7小时，与之前对健康人群的研究相一致。总体而言，肠道传输时间似乎聚集在间隔大约24小时的间隔内，与使用可摄入的电磁胶囊的相关研究类似。根据已报道的肠道传输时间的标准值，本研究将受试者的肠道传输时间分为三组：(G1) <14小时-快速肠道转运时间组；(G2)14~58小时-正常肠道转运时间组；(G3) ≥59小时-缓慢肠道转运时间组。由于正常肠道在G2中的转运时间呈双峰分布，因而将其进一步分成两个类别，分别在14~38小时和38~58小时之间(图1B)，最终得到总共四个不同的肠道传输时间组别：C1-(平均0.38天，n=97)，C2-正常(平均1.02天，n=424)，C3-正常(平均2.01天，n=186)和C4 (平均4.21天，n=174) (图1C)。

图1. PREDICT 1队列中患者的肠道传输时间。(A) PREDICT 1队列的研究设计，重点关注患者的肠道传输时间。(B) 肠道传输时间分布直方图，橙色虚线表示四个类别的边界(C1：肠道快速传输时间；C2和C3：肠道正常传输时间；C4：肠道缓慢传输时间)。(C)四种肠道传输时间的小提琴曲线图，其中C1、C2、C3和C4的平均传输时间分别为0.38、1.02、2.01和4.21天。(D)根据Bristol粪便类型分布的肠道传输时间以及(E)与PREDICT 1队列开始前一周报告的排便次数的分布。*表示经Mann-Whitney U检验具有统计学差异，p<0.01，样本少于10个的类别没有进行显著性分析。

2 肠道传输时间与排便形式和频率之间的关系

由于粪便形态和肠道微生物组之间的关系已经被报道，因此研究者分析了肠道传输时间与排便形态之间的关系(图1D-E)。在该研究中，较低的BSF评分对应较长的肠道传输时间( 1型的中位数大于5天)，而较高的BSF评分对应较短的肠道传输时间(6型的中位数为1天，图1D)，上述结果与之前使用射频不透明标记技术的研究结果相一致。

在PREDICT 1研究开始前一周记录了受试者排便的频率。受试者报告出现1~3次排便频率约有32.8%)，出现7次或更多的约有67.2%，而没有受试者报告出现4~6次的排便频率。相关的研究表明，粪便形态小而硬一般较难排出，且通常在24小时内排出。因此，不经常排便的人可能需要在两次排便之间至少需要24小时才能产生足够大的排便量，从而刺激排便。肠道运动频率与肠道传输时间进行比较，具有统计学意义的是，肠道运输时间越长，每周排便次数越少(p=1.2e-8，图1E)。综上所述，该研究通过一项大规模队列研究证实，用蓝色染料法测量得到的肠道传输时间与粪便黏稠度呈负相关，而与排便频率呈正相关。

3 肠道微生物组和肠道转运时间之间存在显著关联

研究者进一步分析了肠道传输时间与肠道微生物之间的潜在联系，同时考虑了微生物的分类及功能特征。基于动物实验的相关研究已经证实，肠道传输时间可以影响肠道微生物的组成和功能，同时药物引起的肠道传输时间的改变可影响远端肠道的微生物组成。然而，通过蓝色染料方法计算得到的肠道传输时间对肠道微生物的影响尚未在大规模的人体队列研究中得到证实。为了解决上述问题，研究者首先分析了不同样本的a多样性，其指数变化可以反映微生物群的多样性程度，使用了丰富度 (即，检测到的物种数量，图2A)和Shannon指数，后者既考虑了均匀性，又考虑了丰富性。与之前的研究一致的是，本研究发现a多样性(丰富度和Shannon指数，p值分别为1.7e-4和7.1e-6)和肠道传输时间(图2AB)有显著的相关趋势，这可能是肠道运输时间延长的结果，使更多的微生物物种得以沿着肠道不断积累。此外，较长的肠道传输时间增加了底物在腔内的滞留时间，并使得结肠的微生物更多地利用和发酵碳水化合物和蛋白质，从而提高微生物的多样性。上述易发酵底物的消耗已被证明可以提高蛋白质分解和糖解发酵的比率，并有助于生长相对缓慢的微生物物种的增殖。此外，蛋白水解发酵的增加被认为是以牺牲短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)为代价来增加支链脂肪酸的产量，从而削弱了SCFAs对宿主健康的一些有益影响。

接下来，研究者基于变异多变量分析(PERMANOVA)分析，分别测试了不同肠道传输时间组别的受试者的微生物组成是否具有显著差异。研究者发现C1-快速组和C4-慢速组可以解释b多样性中17.1%的差异，表现出比BSF类型(解释度11.5%)更强的效应(图2B)。根据PERMANOVA分析，除C1-快速组和C2-正常组外，所有肠道传输时间分组之间均具有显著性(p<0.01)。

鉴于肠道传输时间和肠道微生物与a多样性和b多样性之间的关联，研究者进一步探索了肠道微生物组成和功能特征是否可以预测四种肠道传输时间类别(图2C-D)。通过使用机器学习分类模型，首先区分两种极端的肠道传输时间类别，因为根据b多样性分析，其在微生物组成方面具有更大的差异(图2B)。为了验证这不是比较两个极端类别的结果，研究者还将C1-快速组和C2-正常组视为一个类别，将C3-正常组和C4-慢速组视为另一个类别，机器学习分类任务显示AUC为0.72(图2C)，这表明肠道传输时间与肠道微生物的组成之间存在直接关系。研究者进一步研究了上述关联，在模型中包括微生物的相对丰度、通路功能分析(图2D)和HUMAnN2评估的基因相对丰度。有趣的是，最不明确的比较是C1-快速组和C2-正常组之间，而新定义的肠道正常传输时间的两个亚类(即C2-正常组和C3-正常组)，对应于大约1天和2天，显示出更明显的肠道微生物组成变化。

为了验证之前显示的微生物组与肠道传输时间的相关性，研究者分析了BSF量表和肠道蠕动频率是否具有类似的结果，考虑到它们在研究中通常被用作肠道传输时间的代表性评价指标。研究者首先分析了BSF类型和排便频率是否与微生物α多样性有关(图2E-F)。虽然上述某些结果之间具有一定的统计学意义(p<0.01)，但与通过蓝色染料法得到的肠道微生物和肠道传输时间之间的关联相比，使用机器学习分类模型得到的肠道微生物、BSF分型和肠道传输频率之间的关联较弱(图2G)。尤其是，研究者认为两个极端的肠道传输时间分型(253名受试者)比两个极端的BSF粪便分型2和6(117名受试者)更具代表性。综上所述，研究者发现受试者的肠道微生物与肠道传输时间之间具有很强的关联性，而且上述关联可能比排便频率或粪便稠度的关联性更强。

图2. 与Bristol 粪便类型(BristolStool Form，BSF)、规模和排便频率相比，肠道微生物的组成分析更能预测肠道传输时间。(A)四种肠道传输时间的Shannon 指数分布。(B)基于Bray-Curtis距离算法的PCoA显示根据肠道传输时间类型着色的微生物组样本。(C)ROC曲线显示机器学习(machinelearning，ML)模型预测两个极端肠道传输时间类型：C1和C4(AUC=0.82)；C1和C2 vs C3和C4(曲线下面积AUC=0.73)。(D)利用菌群物种相对丰度和基因功能通路信息进行肠道传输时间分类的ML分类矩阵。(E)基于Shannon指数和Bristol粪便类型衡量的菌群α多样性。(F)基于Shannon指数和肠道蠕动次数衡量的菌群α多样性。(G)基于物种和功能途径相对丰度进行Bristol排便类型分类的ML分类矩阵。

4 肠道菌群是微生物组-肠道运输时间之间关联的驱动因素

基于肠道传输时间和肠道微生物组之间的关联性，研究者进一步尝试挖掘出可能与肠道传输时间长短相关的潜在单一微生物物种。该研究首先考虑了两个极端肠道转运时间组别C1-快速组以及C4-慢速组之间相对丰度至少是两倍的物种(图3A)，同时考虑平均相对丰度>1%的重要物种，并显示了上述物种在四个肠道传输时间分组中的分布情况(图3B)。除了Eubacterium rectale外，基本上所有物种的相对丰度都随着肠道传输时间的延长而增加，但Eubacterium rectale的丰度在肠道传输时间较长的种类中丰度较低。E. rectale作为一种糖化菌，因此其丰度可能会在较长的肠道传输时间受试者体内减少，此时会发生向蛋白水解新陈代谢的转变。与之前的研究类似，拟杆菌门中的Akkermansia muciniphil、Bacteroides和Alistipe spp在较长的肠道传输时间组别中的丰度较高。在之前已报道的53名健康女性的小型队列中也发现A. municiphila的相对丰度与肠道传输时间正相关。值得注意的是，在目前的研究中，Ruthenibacterium lactatiforman在肠道传输时间较长的组别中的丰度更高，在同一PREDICT 1队列中其相对丰度与较差的心脏代谢相关标记物有关。

    接下来，研究者利用基因家族的功能数据进行了类似的分析，并证明了不同肠道传输时间组别之间的通路差异比物种间的差异更显著。研究者认为有差异的途径(FDR调整后的p<0.01)，其效应大小至少为两倍并根据四种肠道传输时间组别来分析上述途径的分布(图3C)。肠道传输时间越长，丙酮酸转化为丙酸的发酵速率越高。值得注意的是，在更长的肠道传输时间组别中，该研究同样发现了从H₂和CO₂生成甲烷途径的增加，这与便秘患者观察到的甲烷产量增加相一致，以及在较长的肠道传输时间组别中观察到的Methanobrevibacter丰度的增加。然而，之前的一项病例对照研究表明，呼气中甲烷的产生与粪便微生物的组成有关，但与肠道传输时间无关。最后，研究者确定了32个有显著差异的物种(FDR调整后的p<0.01)，其代表了肠道传输时间的两个极端类别。为了进一步了解微生物特征是否与肠道传输时间有关，研究者鉴定出了具有BSF量表两个极端(类型1和类型2与类型5和类型6)特征的重要物种(FDR调整p <0.01)，发现只有10个物种与肠道传输时间一致(图3D)，这表明通过蓝色染料方法测定得到的肠道传输时间与肠道微生物群组成的关联性比BSF分型更高。

综上所述，宏基因组测序揭示了微生物组-肠道传输时间之间关联的明确驱动因素。更具体地说，更具体地说，随着肠道传输时间的延长，与丙酮酸发酵和甲烷生成相关的途径有所增加，而肠道中A. muciniphila的丰度也与较长的肠道传输时间有关。上述发现可能促进研究者对肠道微生物影响健康人群生理状态和相关功能机制的深入理解。

图3. 与肠道传输时间相关的微生物种类和功能途径分析。(A)12个显著差异物种在C1和C4不同肠道传输时间类型中的丰度情况(经FDR校正后p<0.01)，其效应大小至少为2倍差异。(B)在PREDICT1队列中确定的生物标志物在四种肠道传输时间类型中的相对丰度，平均至少为相对丰度的1%。(C)具有显著性的功能通路的相对丰度分布情况 (经FDR校正后p<0.01)，其效应大小至少是前者的两倍。(D)经FDR校正后确定的肠道传输时间和BSF分型的重要物种，其中有10种物种是共有的。

5 肠道传输时间与饮食和心脏代谢指标之间的直接联系十分有限

目前关于饮食与微生物组之间的关系以及饮食和微生物组对宿主健康影响的研究已十分明确。考虑到肠道传输时间和肠道微生物组成之间的密切联系，研究者分析了肠道传输时间、习惯性饮食和心脏代谢健康之间的潜在联系。该研究通过用物种相对丰度训练的机器学习模型回归模型来预测肠道传输时间。接下来，研究者评估了测量的肠道传输时间与预测值之间的相关性。为了进行比较，研究者开发了一项基于机器学习回归模型，该模型通过物种相对丰度来预测饮食和心脏代谢标志物，结果显示肠道运输时间是与微生物组组成相关的最主要变量之一(图4)。

为了研究肠道传输时间与微生物组和饮食相关标记之间的关系，研究者考虑了两种a多样性指标，即丰富度和Shannon指数，以及前5个门中排名前10个物种的相对丰度。针对与饮食相关指标(根据食物频率问卷调查，Food Frequency Questionnaire，FFQ估计)，研究者分析了营养素和能量调整营养素、单一食物、食物类别和饮食指数。该研究涉及的心脏代谢健康标记物是之前用来定义微生物健康特征的标记物。结果显示，总体上的相关性低于基于微生物组的特征(图4)。值得注意的是，根据上述发现，研究者认为肠道传输时间是ML分类任务的一个附加特征，用于预测19个心脏代谢健康相关标志物。上述结果说明肠道传输时间与习惯性饮食之间没有直接联系，或者就微生物组的贡献而言，这种联系是冗余的。该结果是令人意外的，因为在动物和人体试验中，营养物质的干预已被证明可以显著影响肠道传输时间。然而，上述发现主要来源于短期的干预试验，而非大规模的临床研究。此外，正如之前在短期饮食干预中报道的那样，饮食干预可能对肠道运输时间有短暂的影响。因此，在确定饮食对肠道传输时间的影响方面，通过FFQ获得的习惯性饮食信息可能不像详细的前瞻性饮食记录那样有见地。此外，FFQ仍然存在有几个局限性，包括测量误差、食物列表有限以及估计的份量不准确。另一个解释可能是影响肠道运动的神经肌肉功能可能与饮食和肠道微生物无关。例如，中枢神经系统和肠道神经系统，以及免疫和内分泌系统等也被证明可以影响肠道运动。

图4. 肠道微生物组和肠道传输时间在预测健康指标和饮食中的作用。肠道微生物群：微生用于训练机器学习(ML)回归分析的微生物组物种相对丰度的箱形图，以预测预测肠道传输时间(如图所示的100倍)和健康标记、饮食模式、营养(根据能量摄入调整或不调整)、食物组和单一食物的每个标记的中位数。与健康标记和饮食相比，使用微生物谱使肠道传输时间具有更好的可预测结果。肠道传输时间：肠道传输时间与微生物相关和饮食标记物相关的箱形图。肠道传输时间和微生物组的相关标记包括两个a多样性测量(丰富度和Shannon指数)，以及根据其平均相对丰度，前五个门中每一个包含丰度最高的前10个物种。肠道传输时间和饮食相关标记包括单一营养素和能量调节营养素，单一食物和根据植物性膳食指数、膳食指数和之前研究工作中用于定义心血管代谢性健康特征的19个健康标记物。

6 肠道传输时间、肠道菌群、饮食和健康之间相互关系的模型分析

由于饮食、微生物组和肠道运输时间对宿主后续健康影响之间的复杂相互关系，研究者通过结构方程建模(structuralequation modelling，SEM)研究了上述的相对影响。研究发现肠道传输时间与肠道微生物之间具有很强的相关性(β=0.98)。同时，肠道传输时间与内脏脂肪(β=0.83)和餐后血糖反应(β=0.69)有独立的正相关；肠道传输时间越长，则内脏脂肪越多，且餐后血糖反应越高(而这两个因素都是心血管疾病的独立危险因素)。相反地，肠道微生物群与内脏脂肪(β=−0.87)和餐后血糖反应(β=−0.68)呈独立的负相关。肠道微生物群“更健康”则预示着较低的内脏脂肪和餐后血糖反应。有趣的是，肠道传输时间和肠道微生物都与血压或炎症反应无关。正如该研究预期的，饮食质量(由Healthy Eating Index 2010，HEI衡量)与所有健康指标都是独立负相关的。然而，饮食质量高低与肠道传输时间无关，这与基于ML回归任务分析的结果相一致。

图5. 利用结构方程模型来确定微生物组、肠道传输时间、饮食和健康干预措施之间的关系。血压(收缩压和舒张压的平均值)、炎症(空腹血糖和IL-6的平均值)、餐后反应(峰值葡萄糖水平和甘油三酯的平均值)和内脏脂肪。模型定义，用方框表示明显的节点，箭头表示指向回归结果的回归系数(每个箭头上的标准beta值仅用于显著相关显示(p<0.05)。

在本文中，研究者开发了一种新型、廉价并且可扩展的肠道传输时间评估方法，并系统的研究了人体肠道传输时间与(1)粪便的粘稠度和排便频率；(2)肠道微生物的组成和功能；(3)习惯饮食和心脏代谢健康之间的关系。由于粪便的蓝色染料法不需要专门的工作人员以及前往诊所进行评估，受试者能够方便的使用超市中常见的成分进行远程的评估，因此上述方法将很有希望应用于大规模的流行病学研究，以评估人体肠道的传输时间及其相关功能。研究者在本文中首次发现，使用蓝色染料方法测量的肠道传输时间与粪便的粘稠度和排便频率，以及肠道微生物的a多样性和菌群整体组成结构之间具有很强的相关性。后者还可以在不同的蓝色染料分类的肠道传输组别之间加以区分，尤其是在肠道传输快速组和肠道传输慢速组之间，并且某些特定的细菌物种还可以作为微生物组-肠道传输时间之间关联的驱动因素。值得注意的是，就菌群的相对丰度和a多样性而言，肠道传输时间比粪便硬度和排便频率更能解释肠道微生物组的变化。上述结果表明，通过蓝色染料方法测量的肠道传输时间，可能比粪便浓度和频率更能反映健康人群的肠道功能。此外，蓝色染料法也可以预测健康人餐后的脂质和葡萄糖反应以及内脏脂肪，这是衡量健康的关键指标。因此，上述方法的使用将有助于推进精确医学。因此，未来的研究不仅要评估肠道传输时间对其相关表型的影响，还应该采用一种标准化的方法来准确评估肠道传输时间。

虽然本研究是第一次大规模地来研究一种新型、低廉的肠道传输时间标记物，并在健康人群中测定肠道传输时间与肠道微生物之间的关系，但目前仍然需要承认该方法所面临的一些局限性。首先，本研究所涉及的蓝色染料法还没有被其他肠道传输方法验证过，如不透明的放射标记技术或闪烁成像。然而，该研究确实将这种方法与大便硬度测定法进行了比较，并且粪便的硬度已被证实是肠道传输时间的替代指标之一。然而，粪便硬度是根据人群过去3个月的回顾情况进行评估的，这可能产生了一些不准确的数据，同时之前相关的研究也提出过粪便硬度评估的问题。此外，如果本研究同时还记录了对微生物组结果进行分析的粪便样本的硬度情况，则研究结果的可信度可能会得到加强。在接下来的调查中，研究者将尝试对蓝色粪便样本进行测序分析。此外，记录蓝色染料在后续排便中出现的持续时间可能为本研究提供了更多的证据，但上述数据在目前研究中并没有记录。

综上所述，上述研究结果表明，蓝色染料方法作为一种新颖、低廉并且可扩展的肠道转运时间的评估方法，可以为评估人体肠道健康和代谢变化提供有价值的参考依据。与此同时，上述方法在基础研究和临床实践中的广泛应用也可以促进人们对人体肠道功能及其关键影响因素以及肠道生理环境和宿主健康之间复杂的相互作用的深入理解。

了解健康人的肠道传输时间和肠道菌群之间的联系是十分有意义的，因为肠道微生物群对宿主生理以及健康和疾病状态之间的过渡具有潜在的影响。肠道传输速率被认为与饮食、宿主新陈代谢和健康(包括心脏代谢健康)之间密切相关。例如，肠道的转运过程可能通过调节营养物质的吸收和微生物的组成来影响餐后血糖和血脂水平。然而，上述观点仍有待在大规模的人体研究中进行证实。因此，使用新型的评估技术可以得到大量的人体肠道传输时间的相关数据，并且随后的分析也能为肠道生理和宿主健康之间的复杂相互作用提供新的见解。本研究的分析是基于PREDICT 1临床试验(NCT03479866)中进行的，主要评估了来自英国和美国的双胞胎和非亲属关系成年人的肠道传输时间、肠道微生物组、代谢变化、膳食组成。本研究的主要目的是评估一种新型、低廉的肠道传输时间测定方法，并研究肠道传输时间与(1)大便的稠度和排便频率；(2)肠道微生物的组成和功能；(3)心脏代谢健康和饮食之间的关联。

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