科研资讯 - Frontiers in Immunology

越来越多的研究揭示，深入理解肿瘤微环境特别是肿瘤浸润免疫细胞的特征，对探究肿瘤发生发展和免疫疗法的关键调控分子至关重要。近年来，单细胞转录组技术成为解析肿瘤微环境的有力武器，在相关研究中取得了一系列突破进展。

Frontiers in Immunology 「IF: 7.561」发表了一篇基于肿瘤免疫浸润及与单细胞测序分析的文章：PNOC Expressed by B Cells in Cholangiocarcinoma Was Survival Related and LAIR2 Could Be a T Cell Exhaustion Biomarker in Tumor Microenvironment: Characterization of Immune Microenvironment Combining Single-Cell and Bulk Sequencing Technology。这篇文章通过单细胞测序技术定位胆管癌免疫浸润相关基因，更好地指导了免疫治疗的临床应用。

背 景

胆管癌长期以来被认为是一种预后差的肝癌恶性肿瘤。胆管癌患者往往出现在晚期，不适合手术治疗，很少从化疗或综合治疗中获益。目前用单抗、Pembrolizumab 和 Nivolumab 阻断 PD1/PDL1 轴揭示了部分肿瘤中 PDL1 高表达患者的情况，但晚期 CCA 患者的整体治疗效果仍需进一步观察。了解肿瘤免疫微环境及胆管癌浸润情况，可更好地指导免疫治疗的临床应用。

图：技术路线

主要结果

1、单样本基因集富集分析「ssGSEA」

首先下载 TCGA 数据库中胆管癌「CCA」「CHOL，n=36」的数据集，并计算了每个样本中28种免疫细胞类型「TISBID数据库」的浸润评分。根据计算评分对CCA患者进行聚类后，发现组间免疫状态明显不同「图1A」。另外，使用免疫刺激因子、抑制剂、主要组织相容性复合体「MHC」分子、趋化因子和趋化因子受体的基因列表来计算相应评分：在高免疫浸润患者中，这些基因的表达水平要高得多「图1B」。免疫浸润程度高的患者预后也较好「图1C」。

结论：通过ssGSEA分析方法将TCGA 数据集中的CCA患者分为具有不同预后的高免疫浸润组和低免疫浸润组。

2、CCA患者中高、低免疫浸润组之间的差异分析和富集分析

使用 edgeR 包分析高浸润组和低浸润组之间的差异表达基因：高浸润组中有 43 个基因表达上调「图1 D, E」。

之后的富集分析分为以下步骤：

1. REACTOME 数据库注释显著变化通路：高浸润组 43 个上调基因的富集分析显示主要与炎症信号、免疫刺激和 PD1 轴相关「A, B」。

2. GO富集分析：43 个基因参与了适应性免疫应答和T细胞信号转导过程「C, D」。

3. 差异表达基因的蛋白质功能富集：43 个基因大部分为免疫球蛋白「E, F」。

4. GSEA 富集分析：高度富集于补体信号、IL2/STAT5 信号、IL6/JAK/STAT3 信号、炎症反应信号、干扰素 γ 信号和通过 NFKB 的 TNFA 信号等途径「M-R」。最后进行生存预后分析，发现 PNOC、TRBC1、TRAV29DV5、IGLV3.16、AC244205.1 与胆管癌患者总生存期显著相关「G-L」。

结论：高免疫浸润患者与低免疫浸润患者的差异表达基因主要为免疫功能相关基因。高免疫浸润患者高度富集于炎症通路。

3、逐步回归模型筛选关键基因

在这里还结合了 GEO 数据库的数据集。计算 GSE26566「n=104」和 GSE32225「n=149」数据集的免疫浸润评分。同样根据评分将 CCA 患者聚类为高浸润和低浸润组，之后分别使用逐步回归模型预测上述的 43 个基因。结果：发现图 4中几个基因与免疫浸润状态相关，其中在两个数据集中都发现 LAIR2 与高免疫浸润状态有关。

4、单细胞测序分析及预后分析

单细胞测序分析：单细胞测序数据来源于 GSE138709 数据集「5 例肝内胆管癌患者」。聚集的细胞数量从 15 个「A」集群到 7 个细胞群：成纤维细胞、NK&T 细胞、恶性细胞和胆管细胞、内皮细胞、单核细胞、肝细胞、B细胞「B」。聚集到的细胞主要是用 CD7、CD3D、KRT19、FXYD2、CD14、CD1C、CD79A、VWF、APOC3 和 ACTA2 进行标记的「C」。结果：恶性肿瘤细胞和胆管细胞群大部分来自肿瘤样本，NK&T细胞群大部分来自邻近样本。此外，在肿瘤样本中也可以看到高比例的成纤维细胞「D-F」。

预后分析：此外发现 PNOC 在肿瘤组织中高表达，但在正常组织和肿瘤组织之间差异不显著「A」。逐步回归模型检测到 PNOC 主要通过 B 细胞群体表达「B-D」。TCGA CHOL 样本中 PNOC 与 B 细胞也高度相关「E-H」。

结果：CCA 中 B 细胞浸润评分高与较好的预后相关「I-L」。GEPIA 数据库检测到 CHOL 样本中，PNOC 与 CD19、CD79A、CD27、FCRL5等标记基因也高度相关 「图M-P」。

结论：进一步证实CCA肿瘤微环境显示PNOC主要由B细胞表达，这也是预后较好的指标。

5、亚群分析

先将 NK 细胞和 T 细胞分成亚群：发现 LAIR2 由 Foxp3+ 调节性「Treg」T 细胞和 CD8+/GZMB+ T 细胞群表达「A,B」。再将 CD8+/GZMB+ T 细胞分为 5 个亚簇。在亚簇中，免疫因子「TGFB1, CD96, TIGIT和LAG3」及 LAIR2 都高表达「C-E」。LAIR2 不仅与 CHOL 样本中的 Treg 和 CD8+ T 细胞相关「G-J」，还与 Treg 细胞标记物「CD4、FOXP3、CD25 和 CD39」和 CD8+ T 细胞标记物「CD8A、GZMB、TIM3 和 PD1」存在高相关性「O-R」。

考虑到免疫调节是通过免疫调节因子协同进行的，还分析了LAIR2、PNOC与常用免疫调节因子之间的相关性。

果：CHOL测序样本中，LAIR2和PNOC均与一组免疫抑制剂和刺激因子显著高度相关。

结论：在 CCA 样本中，LAIR2 表达上调，主要由调节性 T 细胞和 CD8+/GZMB+ T 细胞亚群表达。

6、REACTOME通路分析

为了计算和分析恶性胆管癌细胞的通路评分，作者使用了 scTPA工具「用于激活通路单细胞分析」。通过恶性肿瘤和胆管细胞簇的样本来源提取恶性细胞表达基质，然后将表达基质上传到网上。分析结果被下载以作进一步研究。

在这里作者从胆管细胞的表达中提取恶性表达矩阵「GSE138709」，并计算每个细胞的 REACTOME 通路评分。根据计算的分数将恶性细胞聚类为11个群体「a, b」。聚类 11、2、7、8 和 9 显示了高度恶性特征，在细胞有丝分裂周期、IL1 信号、PD1 信号和 PI3K 信号的高表达「c」。

结论：CCA细胞在单细胞水平上表现出异质性通路变化，表明不同肿瘤细胞簇的功能差异和恶性潜能。

总 结

作者围绕 ssGSEA 获得的评分结果展开，采用逐步回归模型筛选标志性基因。将获得的浸润型免疫细胞进行亚群分析，及借鉴多个外部数据库得到验证。其间引入相关性分析及预后生存分析曲线验证标志基因与癌症的预后关系。主要文章思路清晰可见，分析面面俱到。研究的角度方法值得借鉴，感兴趣的小伙伴可以仔细研读。

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