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[转载]硫化氢 (H2S) 信号在植物发育和逆境反应中的作用（下）

已有 5109 次阅读 2021-3-16 13:56 |个人分类:论文|系统分类:论文交流|文章来源:转载

本文转载自刘海科学网博客

硫化氢信号在植物发育和逆境反应中的作用

刘海[撰/译]，王继铖，刘建豪，刘彤，薛绍武

（华中农业大学生命科学技术学院，湖北武汉 430070）

文章链接：https://doi.org/10.1007/s42994-021-00035-4

补充信息下载：https://static-content.springer.com/esm/art%3A10.1007%2Fs42994-021-00035-4/MediaObjects/42994_2021_35_MOESM1_ESM.docx

四. H₂S有助于植物的生长和发育

1. H₂S促进种子萌发

种子萌发是植物生命周期中最关键、最脆弱的阶段，因为它极易受到伤害、疾病和环境胁迫。近年来，许多研究表明H₂S参与了种子萌发过程。H₂S以剂量依赖的方式影响种子萌发，但过高的浓度会导致萌发被抑制。H₂S能促进黄瓜种子的发芽能力、发芽效率和幼苗生长。在大豆、玉米、小麦和豌豆中，H₂S可以提高种子的发芽率和幼苗大小，缩短种子的发芽时间。有趣的是，没有施用外源硫肥的萌发种子内源 H₂S含量增加。H₂S的增加与D/L-Cdes和CAS的高活性有关。高粱发芽种子中CAS表达和生化特性再次证实了高CAS活性促进种子萌发。NaHS处理对打破种子休眠无效，因为ABA对des1和WT种子萌发的抑制程度几乎相同。令人惊喜的是，H₂O₂也能促进种子萌发，表明H₂O₂和H₂S能协同促进种子萌发。用H₂O₂浸泡麻疯树种子，通过刺激L-CDes的活性，促进了H₂S的积累，从而大大提高了种子的萌发率。反之，NaHS处理也增加了萌发种子内源H₂S和H₂O₂的含量，H₂O₂的积累滞后于H₂S，表明在绿豆种子萌发过程中H₂S在H₂O₂的上游起作用。H₂S和H₂O₂均能显著促进子叶蛋白酶活性和游离氨基酸总量的产生。这些结果表明，H₂S和H₂O₂都可以通过活化贮藏蛋白促进绿豆种子的发芽。目前，H₂S对种子发芽的影响机制仍然不清楚。植物激素串联、DNA修复、蛋白质PTMs、代谢产物合成和mRNA转录都对H₂S信号有潜在的响应。

2.H2S对根系发育的双重作用

H₂S对根系发育具有双重调节作用：低浓度时促进根系生长，高浓度时抑制根系生长。外源应用低浓度NaHS可促进根系细胞中L-CDes的活性，增加内源H₂S的含量，直接促进根系的发育和生长。采用特异性荧光探针WSP-1对番茄根中H₂S进行跟踪，结果证实H₂S的积累与原基起始和侧根出现有关。此外，对内源H₂S的原位荧光追踪显示，H₂S只在出现侧根的初生根外层细胞中积累。采用药理和生化相结合的方法，研究了H₂S、NO、CO、吲哚乙酸(IAA)和Ca²⁺对根系发育和生长的调节作用。结果显示，H₂S和NO在NaHS处理后的甘薯幼苗茎尖中迅速增加。但是，IAA转运抑制剂NPA和NO清除剂cPTIO消除了H₂S的诱导作用。Fang等(2014b)观察到，生长素缺乏诱导的SlDES下调会降低DES活性和内源H₂S含量，并抑制侧根形成。相反，NAA或NaHS处理可以诱导内源H₂S，从而以相同的方式刺激侧根的形成。通过HT预处理逆转了NaHS和NAA调控的细胞周期调控基因，包括上调的SlCDKA;1和SlCYCA2;1，以及下调的SlKRP2。这些结果表明H₂S是生长素信号的下游成分，可触发侧根形成。

对于氧化信号，NO和CO促进根系生长的作用类似于低浓度的H₂S。外源施用NaHS和血红素氧合酶-1(HO-1)诱导剂血红素通过触发细胞内信号事件诱导番茄幼苗侧根形成，这些信号事件涉及番茄HO-1的诱导和细胞周期的调节基因。因此，HO-1/CO可能参与了H₂S诱导的番茄侧根形成。SNP可以刺激内源性H₂S的产生和相关酶基因的表达。H₂S缺乏可阻断NO对细胞内Ca²⁺和CAM1转录水平的刺激作用。此外，Ca²⁺螯合剂或Ca²⁺通道阻滞剂减少了H₂S诱导的侧根形成。这些结果表明，在促进根系发育的过程中，H₂S和Ca²⁺信号的相互作用是NO信号的下游。此外，甲烷(CH₄)对根系生长和发育的影响也被发现与H₂S信号有关，这与CA情况也一致。外源CH₄通过刺激相应酶的活性增加内源H₂S水平，从而诱导CsDNAJ-1、CsCDPK1、 CsCDPK5、 CsCDC6、CsAux22D-like和CsAux22-like的表达。最近的转录谱分析研究进一步证实了CH₄和H₂S之间的关系，具有代表性的细胞周期调控基因、miRNA及其靶基因被确定，这些基因主要参与CH4和H₂S促进根的发育。

高浓度的H₂S还可能作为抑制植物根系发育和生长的信号。这种情况与上述途径有不同的调节机制。高浓度H₂S通过抑制生长素的运输来抑制初生根的伸长。PIN蛋白的囊泡转运和分布是一个肌动蛋白依赖的过程，而H₂S通过控制几种肌动蛋白结合蛋白(ABPs)的表达和抑制拟南芥根中丝状肌动蛋白束(F-actin)的占用率来改变PIN蛋白的极性亚细胞分布，最终抑制生长蛋白的极性转运。另外，H₂S对肌动蛋白F-actin的影响在T-DNA插入突变体cpa、cpb和prf3中部分缺失。过表达LCD/OASA1的株系中肌动蛋白束密度和肌动蛋白束/球状肌动蛋白比值较低。肌动蛋白ACTIN2(ACT2)在Cys-287处被巯基化，H₂S的高积累导致微丝束的解聚，进而抑制根毛的生长。此外，高浓度的H₂S通过触发一个包括ROS爆发、MPK6激活和NO积累的信号转导通路来抑制初生根的生长。

3.H2S在光合作用和光形态建成中的作用

当植物遭受各种非生物胁迫时，氧化还原状态的失衡和离子运输的紊乱将极大地限制植物的光合作用。Chen等(2011)已经揭示了H₂S在菠菜光合作用中的作用。NaHS处理除提高叶绿素含量外，还促进了幼苗生长、可溶性蛋白质含量、光合作用和基粒片层堆积数量，同样，光饱和点(Lsp)、最大净光合速率(Pmax)、羧化效率(CE)和Fv/Fm均达到最大值，而光补偿点(Lcp)和暗呼吸(Rd)在NaHS处理下显著降低。H₂S还能增强核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RuBISCO)的活性和RuBISCO大亚基的蛋白表达，与OAS-TL和L-CDes一样。此外，H₂S对水稻的生长和生理也有积极的影响，包括光合作用、光呼吸、叶绿素荧光和气孔。H₂S处理降低了光合作用的氧敏感性、CO₂补偿点和乙醇酸氧化酶(GOX)活性，提高了光合速率和气孔导度。最近的一项研究表明，OASB或SERAT2;1的缺失经常诱导生化或分子特征的拮抗性改变。这些结果表明，H₂S及其相关的S代谢对叶绿体光合作用和相关功能具有重要意义。

H₂S与光的关系还反映在光信号的感知、植物的光形态建成，甚至光胁迫的缓解上。外源H₂S能有效缓解铁皮石斛的光抑制作用。光合作用依赖于植物对光和相关信号转导的感知。H₂S也被发现作用于植物光信号的下游，光信号是由特定波段的光诱导产生的，在谷子幼苗中，下胚轴中的H₂S含量在红光、蓝光或白光下先增加，在白光下增加的持续时间比在红光或蓝光下增加的持续时间长。红光可以提高CDes的活性，蓝光和白光可以降低CDes的活性。LCD1和LCD2的表达受到红光或白光的促进，但受到蓝光的抑制。相反，DES基因受到白光的促进，而受到红光或蓝光的抑制。另外，在光感受器PHYB和CRY1/CRY2的介导下，磷酸化可调节LCDs的活性。这些发现表明光信号网络中H₂S的产生有两种调节方式：一种是直接或间接由光受体介导的LCDs蛋白磷酸化的快速模式，另一种是涉及LCDs和DES基因mRNA转录调节的慢速模式。在光形态建成方面，H₂S促进下胚轴伸长。NaHS处理阻断了COP1从细胞核向细胞质的外流，增加了HY5的降解，从而通过抑制ABI5的表达促进了植物的发育。目前，人们对H₂S是否参与光合作用、光形态建成或光照信号转导还知之甚少。

4. H₂S抵抗衰老和程序性细胞死亡

H₂S在减缓细胞衰老和凋亡方面的功能已经在哺乳动物细胞中被广泛研究，如血管内皮细胞，神经细胞，肾细胞和肿瘤细胞。在植物中也观察到类似的现象。许多外部胁迫因素都可能导致植物的早衰，节律、气候和季节变化也促进了植物的自然老化。外源施用NaHS可以通过维持色素含量的稳定性以及降低植物细胞的呼吸速率、氧化损伤和后续PCD过程，显著延长各种切花、叶片和水果的离体存活时间。ROS的过度积累可诱导植物细胞自噬，H₂S通过抗氧化酶清除ROS的能力依赖于转录和酶活性的增加。

例如，H₂S处理通过维持较高的GPX、APX、CAT和GR活性，降低 LOX、PPO、PAL和蛋白酶的活性，减轻了暗促衰老。同样，糊粉层组织中的NaHS处理导致抗氧化基因HvSOD1、HvAPX、HvCAT1和HvCAT2的转录水平升高，HvEPA和HvCP3-31的转录水平降低。外源 H₂S 可以通过代谢途径增加叶绿素、类胡萝卜素、花青素和抗坏血酸的含量，并下调与叶绿素降解相关的基因的转录，从而抑制黄化过程。赤霉素和乙烯等激素可以诱导衰老，H₂S可以通过潜在的拮抗作用抵消它们的信号。在小麦糊粉层细胞中，H₂S通过恢复H₂S的产生，增加GSH和NO的含量，以及HO-1和α-淀粉酶的表达，减轻GA诱导的PCD。在哺乳动物细胞中，GSH在减轻自噬中的作用已被报道过。例如，一种GSH合成相关基因GCLM的缺失，可能导致成纤维细胞和卵巢细胞的过早衰老。NO在减轻植物衰老中的作用也多有报道。同时，D/L-半胱氨酸和H₂S还通过减少乙烯的合成，可以延缓欧芹和薄荷的衰老时间。

另一种通过H₂S延缓衰老的方法是减少呼吸率，恢复和加强能量代谢。H₂S可以减轻碳饥饿诱导的自噬。随后，H₂S被发现可以通过维持植物的能量状态来延缓衰老。在拟南芥中，des1的线粒体受到严重破坏并在老叶中起泡，而OE-DES1具有完整的线粒体结构和均一的基质。另外，与WT和des1相比，OE-DES1分离的线粒体H₂S产生率、H₂S含量和ATP酶活性水平显著升高，肿胀水平和ATP含量显著降低。此外，DES1缺失引起的H₂S减少也抑制ATPβ-1,2,3的表达，同时诱导ATPε的表达。在转录水平上，H₂S通过调节衰老相关基因来延缓衰老进程。例如，H₂S通过抑制SAG13、ATG8b和ATG12a的表达而减缓叶状细胞的老化，同时诱导SAG12的表达。近年来研究发现，H₂S对番茄叶柄脱落具有剂量依赖性的抑制作用，在脱落过程的早期，可以上调SlIAA3和SlIAA4的表达，而下调ILR-L3和ILR-L4的表达。此外，ABA处理下的蛋白质组学分析表明，半胱氨酸蛋白酶ATG4的巯基化可以调节拟南芥的自噬。H₂S诱导的ATG4蛋白酶的巯基化直接促进ATG8的翻译后加工，从而负面调节自噬的进程。还应该注意到，SO₂缓解植物衰老的作用模式与H₂S的作用模式相似，表明SO₂和H₂S之间的关系是通过硫代谢途径建立起来的。

5. H₂S延缓果实成熟，延长果实采后保鲜

H₂S供体NaHS或Na₂S可显著抑制采后水果的腐烂和霉变，延长其贮藏时间。外源H₂S能调节果实的氧化还原平衡、激素水平、硫代谢和能量代谢，维持各种次生代谢物的稳态，保持细胞壁和细胞膜的完整性，并通过抑制菌丝萌发来抵御各种真菌的入侵(表S2)。

H₂S可以显著增强抗氧化酶的活性，包括CAT，SOD，APX和POD等。有趣的是，H₂S调节氧化还原平衡的机制在不同的水果中是复杂而多样的。在草莓、猕猴桃、梨和甘薯的果实中，H₂S通过降低LOX的活性抑制脂质的氧化。H₂S熏蒸可以抑制苹果、香蕉、番茄和梨果实中PAL和PPO的活性。酚类化合物保持在低水平，这也有助于防止水果，如莲藕，苹果和梨切割后氧化褐变。H₂S还可以提高草莓和猕猴桃中GR的活性。Aroca等(2015)表明，H₂S可以通过S-巯基化物直接增强拟南芥中的CAT活性。Liu等(2017)指出，H₂S增强百合科萱草SOD、CAT和APX的活性，其中APX可能直接受H₂S诱导的巯基化作用调控。在大多数情况下，H₂S增强了抗氧化酶的活性。此外，H₂S还增加了番茄中SlAPX2、SlCAT1、SlPOD12和SlCuZn-SOD基因的表达。这些发现表明，H₂S不仅通过PTM调节ROS，而且在转录水平上调节ROS。

外源H₂S也影响不同的次生代谢过程。对于硫化物和硫酸盐的代谢，H₂S增强了D/L-CDes的活性，从而增加了果实中内源H₂S的含量。在苹果和葡萄果实的贮藏过程中，H₂S熏蒸可以减少糖的积累和可溶性蛋白质的含量。然而，猕猴桃、草莓和桑椹的结果却相反，这可能与不同果实品种间糖酸比值的差异有关。H₂S处理也增加了滴定酸和维生素C在猕猴桃，葡萄和桑椹果中的含量，这有利于降低糖/酸比，延长贮藏时间。在不同植物品种中，H₂S对果实采后呼吸速率有明显的抑制作用，并能维持果实能量代谢的稳定性。H₂S增强了香蕉果肉中H⁺-ATPase、Ca²⁺-ATPase、CCO和SDH的活性，并参调节了果实能量代谢。

猕猴桃和香蕉中，H₂S还通过延缓叶绿素的降解和抑制类胡萝卜素的生产，推迟果实颜色变化。H₂S处理抑制了花青素的积累，也抑制了果实颜色的变化。H₂S处理后，苹果和葡萄果实中黄酮类和酚类物质含量增加，延缓了果实衰老和腐烂。此外，H₂S增强脯氨酸合成酶P5CS的活性，抑制SDH的活性来增加香蕉果肉中Pro的含量。苯丙氨酸的代谢受到H₂S的影响，PAL活性升高，从而降低水果中苯丙氨酸的含量和EGase的活性，表明H₂S通过保持细胞壁的完整性来维持果实的硬度。最近研究表明，内源H₂S在番茄果实成熟中起着重要作用，因为SlLCD1基因编辑的突变体显示了加速果实成熟的作用。

抑制内源乙烯合成和信号转导是H₂S处理延缓果实成熟的重要机制之一。H₂S处理可以通过抑制乙烯合成相关基因(MdACS1，MdACS3，MdACO1和MdACO₂)和信号转导基因(MdETR1，MdERS1，MdERS2，MdERF3，MdERF4和MdERF5)的表达，延长“红富士”苹果的贮藏时间，延缓苹果的成熟。同样，H₂S抑制番茄中乙烯相关基因的表达(SlACO1，SlACO3，SlACO4; SlETR5，SlETR6，SlCRF2和 SlERF2)。H₂S处理下调了香蕉果实乙烯生物合成基因(MaACS1、MaACS2、MaACO1和MaPL)，而上调了香蕉果实乙烯受体基因(MaETR、MaERS1和MaERS2)。

NO可以与ACC氧化酶结合形成稳定的“ACC-ACC氧化酶-NO”三元复合物，具有剂量依赖性。这种信号转导反过来导致乙烯在组织中的产生减少。H₂S和NO供体处理减少了桃果实中乙烯的积累。NO-H₂S串扰对乙烯诱导的果实成熟具有稳定的协同抑制作用。Zhang等 (2014) 报道了外源H₂S和NO的组合可以缓解ROS胁迫，提高果实硬度，增强草莓果实的保鲜。Liu等 (2011) 阐明了H₂S在ET-NO-H₂S信号通路中的下游位置。在水果成熟过程中H₂S与乙烯的信号转导已经被综述。在这些过程中，H₂S与ROS和RNS应激信号相互作用。H₂S和NO的S-巯基化和S-亚硝基化直接发生在植物中，这也是它们调节植物成熟的一个重要途径。

五. 植物中H₂S、NO和H₂O₂信号的多重交叉

在地球历史上，生物进化了新陈代谢和调节机制，以适应不断变化的大气成分：从H₂S到NO再到O₂，从古至今。大量的研究证据表明，在生物体中留下的环境演化的痕迹可能会巧妙地演变成更复杂的信号串扰和调节机制。无论是在哺乳动物细胞还是植物细胞中，H₂S (RSS)、NO (RNS)和H₂O₂(ROS)的特殊作用、功能和机制都离不开它们固有的化学性质和氧化修饰PTMs。因此我们将重点关注这些线索，来帮助我们更好地理解植物中H₂S、NO和H₂O₂参与的多重信号通路。

1. 化学特征和信号: H₂S、NO和H₂O₂

H₂S作为气体分子，具有典型的 “V型”分子结构。气态H₂S具有活性化学性质，可溶于水形成弱酸，称为“硫氢酸”。其水溶液含有HS^-和S^2-，如下:

Step 1: H₂S ↔ H⁺+HS^-; pK_a1=6:88

Step 2: HS^-↔ H⁺+S²⁺; pK_a2=12~17

硫氢酸溶液刚开始是澄清的，放置一段时间后就变浑浊了。这是因为硫氢酸盐会与溶于水的O₂缓慢反应，生成不溶于水的元素S:

2H₂S+O₂=2S^↓+2H₂O

H₂S在体内的浓度很低。因此，吸入过量的H₂S将促进生物体的氧化自救，并将H₂S氧化成低毒性的亚硫酸盐和硫酸盐。此外，将多余的硫形成硫代谢物如硫醇等是降低植物毒性的主要途径。由于H₂S中的硫离子处于-2价，因此H₂S主要作为还原剂。氧化会产生硫酸盐(SO₄^2-)、亚硫酸盐(SO₃^2-)、硫代硫酸盐(S₂O₃^2-)、过硫酸盐(RSS^-)、有机硫化物(RSS_nSR)、无机硫化物(H₂S_n)和元素硫(S_n)的形成。因O₂具有很强的热力学屏障，O₂很难直接氧化H₂S，在体内ROS主要地参与了这一过程。H₂S的初始氧化产物是硫酰自由基(HS·)，它能与抗坏血酸和谷胱甘肽等电子供体发生反应。重要的是，H₂S的单电子氧化可以引发氧依赖的自由基连锁反应，放大初始氧化事件，与过氧化氢(H₂O₂)的反应最初形成HSOH，HSOH可以与第二个HS-反应生成HSSH，即多硫化物。在H₂O₂存在的情况下，最终产物取决于H₂O₂与H₂S的初始比例，主要由多硫化物、单质硫和硫酸盐组成。根据化学和分析研究，H₂S可能是生物系统中氧化剂的直接清除剂。然而，与低分子硫醇相比，H₂S与氧化剂的反应表现出相对较高的速率常数，因此，组织中H₂S(微摩尔)的含量相对较低。此外，在如此低的浓度下，H₂S不能与硫醇竞争结合单电子和双电子氧化剂。这意味着，在生物环境中，H₂S与氧化剂的直接反应不够快，不足以支持显著的清除效果，如上一节所述只有应用足够的外源H₂S才能达到显著的清除效果。综上所述，H₂S的生物“抗氧化”作用可以归因于H₂S本身的直接化学作用和通过酶、转运蛋白和其他伴生物的间接作用的叠加作用。

在哺乳动物体内，NO以NO·的活性形式参与免疫防御、血管扩张和神经传递等多种生理过程，通过sGC中NO·与血红素铁的配位作用，激活第二信使cGMP的生成。H₂S与NO信号相互交织，或者通过与NO·或其下游调控网络反应，或者通过调节体内NO的产生和cGMP水平。NO与H₂S的直接反应早在一个多世纪前就有报道，气态NO可与气态H₂S反应生成N₂O、多硫化物(H₂S_n)和单质硫。然而，这显然不是一步反应，HNO作为反应的实际中间体存在，这在体内也得到了验证。奇怪的是，单电子直接从HS^-转移到NO·生成HNO和S^·-在热力学上是不合理的(^△G₀= +102 kJ/mol)。另一种机制则是形成一种强有力的还原剂HSNO^·-。

NO^·+ HS^- ^→HSNO^·-

这会引发一连串的反应，导致N₂O、H₂S_n和S_n的形成。作为NO与H₂S化学反应的关键节点，HSNO也存在于H₂S与“NO+”载体的反应途径中：酸化的亚硝酸盐、N₂O₃、金属亚硝基醇和S-亚硝基硫醇。其中，N₂O₃与H₂S反应生成HSNO，可能对胞内RSNO的生成起重要作用：

N₂O₃+H₂S ^→HSNO+HNO₂

这个反应发生在细胞膜的脂质双层中，在那里积累的NO和O₂产生了大量的N₂O₃，然后N₂O₃与同样大量的H₂S反应(图3)。在HSNO与硫醇的反应中，HSNO起着“NO+”的作用, 介导蛋白质间和跨细胞膜的转亚硝化作用的载体。此外，RSNO和H₂S的反应促进了HSNO的胞外形成，但HSNO在进入细胞后与RSH反应释放RSNO和H₂S。这也被认为是H₂S穿透细胞膜的有效途径(图3)。这些发现似乎揭示了植物生理中NO和H₂S互补关系的深刻机制。由于NO和H₂S之间发生的化学作用可以产生H₂S_n，这是哺乳动物中H₂S信号的一个增强版本，应确定H₂S_n在植物体内是否存在或具有特殊的生理效应。

图片4.png

图3：植物中H2S、NO和ROS的内源化学信号

2. 关键的翻译后修饰：巯基化、S-亚硝化和亚磺酰化

最近的研究表明，蛋白半胱氨酸残基(RSSH)的巯基化是植物H₂S信号转导的一个重要机制。由于H₂S、NO和ROS介导的蛋白质PTMS都是通过攻击半胱氨酸残基而发生的，因此我们将在这一部分中一起讨论巯基化、S-亚硝化和S-亚磺化。

蛋白质巯基化已被发现参与了S信号通路，在这个过程中半胱氨酸硫醇(RSH)被巯基化成巯基硫醇(RSSH) (图4)。之后，这种后修饰可能会导致靶蛋白的活性、结构和亚细胞定位的功能变化。在哺乳动物中，已证实在各种蛋白质的半胱氨酸残基上存在巯基化现象，如K_ATP通道。Trp通道，Kelch-like ECH结合蛋白1(KeAP-1)、p66Shc，AGE受体(RAGE)，Parkin(一种E3泛素连接酶)，核因子JB(NF-JB)和甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)。Kimura团队的一系列研究表明，在哺乳动物细胞中，H₂S_n也可以介导类似于H₂S的PTM，而且比NaHS更有效。巯基化的发生通过改变半胱氨酸残基和二硫键的性质来调节相应蛋白质的三维构象，从而影响蛋白质的活性和功能。

近年来，由于先进的检测方法和相应的组学分析，植物巯基化的研究取得了一定的进展。用甲硫磺酸甲酯(MMTS)封闭硫醇，抗坏血酸还原，与Biotin-HPDP连接形成生物素标记蛋白后，RSNO最终形成生物素标记蛋白。Aroca et al.(2015)通过改进的BSM总共检测到106个巯基化蛋白质。随后，他们开发了一种比较和定量的蛋白质组学分析方法，检测Col-0和des1叶片中的内源巯基化蛋白。他们确定了2330个潜在的巯基化靶蛋白。KEGG和GO分析显示可能受巯基化调控的蛋白质主要存在于细胞质和叶绿体中，参与碳代谢、非生物和生物胁迫反应、植物生长发育和RNA翻译等过程。对des1和Col-0巯基化蛋白的差异分析强调了DES1产生的H₂S的重要性，它启动了巯基化并调节下游信号。不出所料，DES1产生的H₂S诱导了S-巯基化，参与了拟南芥气孔运动的调节。在气孔对脱落酸(ABA)诱导的反应过程中，DES1能在Cys44和Cys205的H₂S作用下自我巯基化，这对H₂S信号的放大具有重要意义。此外，可持续的H₂S积累可以驱动NADPH氧化酶RBOHD在Cys825和Cys890处的巯基化，增强其产生ROS的能力。同样，SnRK2.6/OST1已被鉴定为在Cys131和Cys137处巯基化，在ABA诱导的气孔关闭过程中激活激酶。值得一提的是，Cys137也可以被S-亚硝化修饰，而不同的是，NO介导的PTM抑制了该激酶的活性。这些发现揭示了半胱氨酸硫醇修饰，特别是巯基修饰在植物气孔运动中的重要性和无限可能性。此外，还发现H₂S介导的巯基化还调节其他植物信号转导途径。H₂S诱导的巯基化可特异性激活胞质中的CAT、APX和GAPDH，这也是H₂S清除ROS的经典酶依赖途径。此外，H₂S通过特异性地巯基化拟南芥中ATG4a蛋白酶的Cys170残基来负向控制自噬的进程。这样就阻止了ATG8的翻译后加工和自噬小体的合成。H₂S介导的巯基化除对ROS清除有正向调节作用外，还具有一定的负效应。H₂S的过度积累降低了F-肌动蛋白束密度和F-肌动蛋白/球状肌动蛋白的比值，因为巯基化发生在ACTIN2的Cys293残基上，从而阻止了肌动蛋白聚合，进而抑制了拟南芥根毛的发育，这与动物实验不谋而合。H₂S不仅动态调节肌动蛋白的解聚，而且影响哺乳动物微管蛋白的稳定性。在番茄中，H₂S处理能使ACC氧化酶LeACO1和LeACO₂巯基化，并抑制它们的活性，表明乙烯诱导的H₂S通过巯基化LeACOs负向调节乙烯的生物合成。总体而言，H₂S在植物中的生理功能远不止上述几个方面，H₂S介导的蛋白质半胱氨酸巯基化的生物学意义值得进一步探讨。

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图4：蛋白质半胱氨酸残基的多重翻译后修饰

S-亚硝化是一种NO介导的蛋白质PTM，是半胱氨酸硫醇修饰的另一种类型。S-亚硝化的概念最早是在1994年提出的，意思是接触高浓度的NO会促进蛋白质半胱氨酸残基硫醇(RSH)形成RSNO，从而调节氧化还原的信号转导 (图4)，RSNO相对稳定，因此被认为是NO储存和运输的主要形式，但它对强还原剂 (即细胞内的GSH和抗坏血酸) 敏感，对金属离子非常敏感，特别是Fe²⁺和Cu²⁺。此外，RSNO还可以与硫醇进一步反应生成二硫化物(RSSR)和HNO，与H₂S反应时，产物为HSNO。然而，另一种反应是HNO和蛋白质巯基化物(RSSH)的形成，这在热力学上是不合理的，而一些蛋白质微环境可以促进这一反应。与H₂S和NO的相似功能不同，巯基化和S-亚硝化可能对蛋白质功能有不同的调节作用。在哺乳动物的组学研究中，巯基化物和S-亚硝基硫醇蛋白质组被报道有36%的重叠。在植物中，S-亚硝化和巯基化之间的关系已经逐渐被揭示(图4)。NO和H₂S在多个途径上存在协同作用，不仅可以促进彼此的酶活性，而且可以缓解各种应激的影响。令人惊讶的是，相对于S-亚硝化，巯基化对SnRK2.6/OST1的影响是相反的，Actin，APX1和GAPDH。S-亚硝化和巯基化在同一位点调节半胱氨酸硫醇(相邻位点的GAPDH)，但对其活性有相反的作用(抑制或促进)。在拟南芥中，共有623个候选蛋白被鉴定为S-亚硝化和巯基化。

当蛋白质半胱氨酸硫醇暴露在ROS下时，可以被氧化成亚磺酸(RSOH)，即S-亚磺化。然后，RSOH可以进一步氧化，形成不可逆的亚磺酸(RSO₂H)和磺酸(RSO₃H) (图4)。H₂S与磺酸反应生成巯基化物(RSSH)，称为巯基化反应。巯基化完成后，RSSH具有双向氧化还原能力，可在硫氧还蛋白(TRX)的作用下还原为硫醇，或在ROS作用下与ROS/RNS快速反应生成加合物(RSSO₃H)。RSSO₃H也可以被TRX裂解，以恢复游离的硫醇和亚硫酸盐 (图4)。在ROS和TRX的动态作用下，RSH和RSSH共同构建H₂S的内生循环，即H₂S由细胞回收再利用。RSSO₃H的形成也是缓解植物内源ROS和RNS激增的一种适应性短期贮藏方式。值得注意的是，仍然没有确凿的证据表明H₂S在巯基化过程中直接作用于半胱氨酸硫醇，比如发现相关的催化酶。因此，RSOH被认为是S-亚磺化、巯基化甚至S-亚硝化的重要中间体。此外，H₂S_n可能是H₂S诱导巯基化的另一种潜在途径，它是由H₂S氧化或由3-MST等酶直接生成S-硫化半胱氨酸残基。在哺乳动物中，先前的研究表明，蛋白质半胱氨酰硫醇的这三种氧化修饰可以相互转化，当其中一种诱发信号占主导地位时，相应的修饰更有可能发生在关键的半胱氨酸位点上。这些结果表明，H₂S、NO和H₂O₂诱导的修饰模式具有强烈的剂量依赖性，这可能解释了为什么使用外源供体时下游信号响应要强烈得多。有趣的是，在没有剂量效应干扰的情况下，这三种氧化修饰在氧化能力上也存在差异，顺序为S-巯基化(RSSH) > S-亚硝酰化(RSNO) > S-亚磺化(RSOH)，这不仅说明了氧化半胱氨酸硫醇的中介作用，而且突出了S-巯基化在半胱氨酸残基修饰竞争中的优先地位。因此，这三种基于半胱氨酸硫醇的修饰似乎是相互调控和相互转化的。对于哺乳动物的MST，半胱氨酸Cys247上稳定的巯基化物可以被H₂O₂氧化成半胱氨酸-硫代磺酸盐、半胱氨酸硫代磺酸盐和半胱氨酸硫代磺酸盐，然后TRX可以将这些修饰的半胱氨酸转化为未修饰的半胱氨酸。最近，在拟南芥的1000多种蛋白质上共鉴定出1537个S-磺化位点。与人类S-磺基化数据集相比，提供了155个保守的S-磺化半胱氨酸，包括拟南芥MAPK4的Cys181。RSOH不仅是半胱氨酸硫醇亚磺化调控的特异性蛋白，也是三种修饰动态调控的基础。此外，跨不同数据库的比较将有助于识别受三重调控调控的目标蛋白。