一、研究背景

1、小分子调节剂可通过几种机制影响其靶蛋白，解开这些生物活性分子的作用机制(MOA)可以进行更好的治疗干预。虽然靶向方法可以评估特定化合物对选定信号通路和细胞过程的影响，但需要系统分析来定义药物和化合物的作用机制。2、目前，药物作用机制的大规模表征主要采用相对高通量，低成本测序技术进行RNA定量。大多数美国食品和药物管理局(FDA)批准的药物都是针对蛋白质的，而RNA和蛋白质水平之间的相关性是有限的，这表明蛋白质水平的变化与相关的化合物作用是最接近的。而蛋白质组范围内的药物筛选工作尚未达到全面蛋白质组的深度,且现有的小分子诱导蛋白表达变化的资源还没有筛选出超过80种化合物。

二、研究手段

将875个小分子以三个生物重复的形式转移到96孔板的HCT116细胞，将细胞与筛选化合物(10µM)、二甲亚砜(DMSO)或阳性对照化合物孵化，后进行裂解、胰蛋白酶消化和TMT 试剂标记；使用一个复制板筛选有毒化合物，将其移除，并用阳性对照化合物的其他重复进行替换，有毒化合物将以较低浓度重新筛选，并实施单独实验，后进行蛋白质组分析。

图1  技术路线

三、研究结果

本次的资源文库包含875个小分子，靶标的914个蛋白质构成约一半的可靶标蛋白。该文库包括临床开发各个阶段的化合物，从高度引用的FDA批准的药物到大部分未描述的化合物(图2 b)。基于每种化合物89%的覆盖率，鉴定到9960个蛋白质，每种化合物鉴定到的蛋白质中位数为8863个(图2 c)。化合物处理后，引起每个特定编码的蛋白质水平变化。本次观察到泊马度胺作用机制的直接证据，即可通过与CRBN21形成三元复合物来降解几种蛋白质。虽然介导免疫调节药物治疗多发性骨髓瘤的转录因子IKZF1和IKZF3在HCT116细胞中不表达，但其他几个转录因子，在重复之间以最小的方差下调(图2 d)。

图2 药物作用机制综合蛋白质组分析平台

2、小分子动态调节蛋白质组

每种化合物可与一个或多个蛋白质靶标相互作用，并通过常见及扰动特异性调节的细胞过程来诱导蛋白质组水平的变化，以此反映其作用机制。将相对于DMSO具有两倍变化，或者蛋白质表达相对于该蛋白质在所有化合物中的平均变化的5个标准差变化，设定为发生调节的标准。基于以上标准，确定超过一半的可量化蛋白质组在一种或多种化合物上变化了至少两倍，而98%的定量蛋白质在一种或多种化合物上显示了5个标准差的丰度变化(图3 a)。值得一提的是，本次发现的141786个调控事件，不到数据集中763万个蛋白质测量值的2%(图3 b)。对于扰动干预引起的差异表达蛋白，通常与耐药性或应激应对途径有关，发现频繁响应的蛋白质只在一个方向上发生变化(图3 c)。上调蛋白富集在与类固醇生物合成、细胞因子相互作用和自噬等通路上，表明HCT116细胞通过上调自噬和固醇代谢来克服外源性应激。而下调蛋白质富集在与细胞周期相关的通路，包括p53信号，这表明这些细胞常通过细胞周期阻滞对扰动源诱导的应激做出反应(图3 d)。

图3 小分子调节蛋白质组

四、结论

875个化合物中包含一半可靶向蛋白质组的调节剂，揭示了HCT116细胞蛋白质组对化学扰动最敏感的部分。这一资源库较以前的资源库大十倍，突出了先前未被重视的蛋白质组如何对药理学药物做出反应的细微差别，为评估配体诱导的靶蛋白调控变化的频率和特异性提供了最大的资源，证明15%的化合物可调节其靶蛋白的丰度。使用蛋白质-蛋白质和化合物-化合物相关网络来揭示几种化合物的作用机制，包括肾上腺素能受体拮抗剂JP1302等，并通过广泛覆盖化学中重叠靶点的化合物，将化合物结构与作用机制联系起来，强调了文库中分子的靶向多药理学。

编辑：Miao.D

审核：Tao Li

参考文献

Mitchell DC, Kuljanin M, Li J, Van Vranken JG, Bulloch N, Schweppe DK, Huttlin EL, Gygi SP. A proteome-wide atlas of drug mechanism of action. Nat Biotechnol. 2023 Jan 2.