枸杞果实以其卓越的营养和药用价值而闻名，新陈代谢和生物活性化合物的合成在枸杞果实中起着至关重要的作用，而目前枸杞成熟过程中的化合物代谢的分子机制还尚不清楚。

宁夏大学在《Postharvest Biology and Technology》期刊发布题为"Multi-omics integration analysis reveals metabolic regulation of carbohydrate and secondary metabolites during goji berry (Lycium barbarum L.) maturation"的文章，通过转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析了枸杞成熟过程中的化合物变化。

研究背景

枸杞 （Lycium barbarum L.） 是一种中国本土物种，因其巨大的营养价值被广泛应用于保健品、医学等领域。枸杞中有50%以上的成分由碳水化合物组成，富含植物化学物质和生物活性物质。果实发育和成熟是复杂、精心编排的生物过程，涉及各种代谢物的转化和积累、错综复杂的蛋白水解途径和精确的基因调控，了解支撑水果发育和成熟的动态代谢过程对于确保水果质量和有效管理至关重要，碳水化合物代谢是水果成熟过程中的重要决定因素，控制着糖含量和其他成分。在该项综合研究中，作者对枸杞果实成熟和采后三个阶段的物理化学指标、非靶向代谢组学、转录组学和蛋白质组学概况进行了全面的综合分析，以使用多组学数据研究水果成熟和采后碳水化合物成分和次生代谢物的差异，阐明代谢转化途径并确定导致这些变化的关键调控因素。

技术手段

实验材料：随机选择10株具有相同生长潜力和健康状况的3年生枸杞植物开花后7天从三个成熟阶段的标记果簇中采集果实；

实验方法：理化指标测定、转录组学、Lablefree蛋白质组学、非靶向代谢组学

主要结果枸杞成熟过程中糖和次生代谢产物的动态变化

在枸杞果实成熟的三个阶段中，糖、总蛋白、甜菜碱和黄酮类化合物的含量发生了显著变化。多糖（Polysaccharide）含量在青壮年期达到峰值，在青壮年期和青壮年期呈下降趋势，半乳糖（Galactose）、果糖（fructose）和总糖（total sugar）含量在成果阶段显著增加，在RF期达到峰值。其中蔗糖（Sucrose）含量在GF期最高，在RF期显著降低。总蛋白含量在3个发育阶段保持相对稳定，黄酮类化合物（flavonoid）含量在YF和GF期差异不显著，在RF期最低。

图1 枸杞幼果、青果和红果成熟期的生理指标。(A)多糖, (B)半乳糖, (C)果糖, (D)蔗糖, (E)总糖, (F)总蛋白, (G)甜菜碱, 类黄酮(H), 不同字母表示差异显著(P < 0.05)。

代谢组学、蛋白质组学、转录组学特征

代谢组学共鉴定出1097个代谢物，其中氨基酸、多肽和类似物占大多数(57,6%)，其次是碳水化合物和碳水化合物结合物(42,5%)，一共129个差异代谢物(DEMs)。

图2 枸杞果实YF、GF和RF阶段代谢组学分析。(A)所有已确定的代谢物类别。(B)所有样本的主成分分析(PCA)。(C)三个果实发育阶段差异表达代谢物(DEMs)维恩图。(D)三个阶段各DEMs表达水平的热图。

蛋白质组学共定性到6905个蛋白，6804个蛋白有定量信息，差异蛋白4044个，其中RF和YF对照组中鉴定出的DEPs数量最多。

图3 枸杞果实YF、GF和RF发育阶段的蛋白质组学分析。(A)三组间差异表达蛋白(DEPs)火山图比较。(B)各DEPs热图。

转录组共获得33312个注释基因，根据相似的时间依赖性变化趋势将其分为6个簇，反映了果实成熟期表达谱的变化，共鉴定出16538个deg，其中RF组和YF组的数量最多，RT-qPCR验证了所选deg的转录组准确性，RT-qPCR验证了所选deg的转录组准确性。对代谢组、蛋白质组和转录组的综合分析显示，RF期的DEMs、DEPs和deg显著富集，表明大量的代谢变化与红果期显著相关。

图4 枸杞果实YF、GF和RF成熟阶段的转录组学分析。(A)所有基因根据随时间变化趋势的相似性分为6个簇, (B)所有差异表达基因(DEGs)的热图、数量、上调和下调

多组学共表达网络及关键调控因子鉴定

共表达分析综合了所有确定的DEMs、DEPs、DEGs和理化指标，揭示了7个共表达模块，从图A可看到在蓝色模块中，L. barbarum蔗糖-磷酸合成酶(LbSPS)基因与7个dem和53个DEPs有很强的相关性，尤其是与D-Glucose。从图B可得到，红色模块中L. barbarum跨膜emp24结构域(LbTMED)蛋白与8个dem和31个DEGs相关。从图C可得到，在绿色和绿松石色模块中，枸杞葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶(LbGLGC)和枸杞果糖-1,6-二磷酸酶(LbFBP)基因分别与64和49(DEGs)相关。

图5 共表达交互网络。(A) DEG-hub的蓝色模块，(B) DEP-hub的红色模块，(C)枢纽基因LbGLGC(葡萄糖-1-磷酸腺苷基转移酶)的绿色模块网络与64个DEGs相关。(D)hub gene LbFBP (L. barbarum fructose-1,6-bisphosphatase)在蓝绿色模块中与49个deg相关。

多组学功能注释分析

对所有的DEMs、DEPs和DEGs进行功能注释分析。KEGG通路富集分析显示，1713个DEGs被映射到292条通路，4044个DEPs被映射到200条通路，22个DEMs被映射到81条通路。DEGs、DEPs和DEMs的前50个KEGG富集圈图显示，与细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、代谢功能类别和生物体系统相关的类别显著富集。

在代谢途径中，DEGs最富集的途径包括代谢途径(ko01100, 803)、次生代谢生物合成途径(ko1110, 487)、不同环境下的微生物代谢途径(ko01120, 164)、核糖体(ko03010, 149)和碳代谢途径(ko01200, 133)。对于DEPs，最富集的途径是核糖体(ko03010, 101)、辅助因子的生物合成(ko01240, 95)和内质网的蛋白质加工(ko04141, 85)。对于DEMs，最富集的代谢通路包括代谢途径(ko01100,14)，次生代谢物的生物合成(ko01110,10)， ABC转运体中的7个DEMs (ko02010)，氨基酸的生物合成(ko01230)，蛋白质的消化和ab-吸附(ko04974)。此外，该分析还强调了糖代谢相关途径中DEGs、DEPs和dem的显著富集。

果实成熟过程中糖和次生代谢物生物合成的调控网络

图A为利用MapMAN对DEGs进行分析，发现它们参与包括碳水化合物代谢、细胞壁代谢、脂质代谢、次级代谢和氨基酸代谢多种生物过程。碳水化合物代谢涉及D-葡萄糖转化为D-葡萄糖- 6P，由L. barbarum glucose-6-phosphate-1- epimase (LbGLP)催化，以响应D-葡萄糖的积累。上调的基因LbGLGC和L. barbarum颗粒结合淀粉合成酶(LbWAXY)促进了D-葡萄糖- 1P随后转化为直链淀粉和蔗糖，图B的BiFC证实了预测的蛋白的强互作。图B可看到LbSPS的下调影响蔗糖代谢，包括L. barbarum β -果糖糠醛苷酶(LbINV)将其转化为D-葡萄糖，L. barbarum raffinose synthase (LbRS)催化形成raffinose catalyzed，然后转化为半乳糖和果糖，导致果糖和半乳糖积累增加，多糖减少。LbFBP将D-果糖-6P转化为D-果糖-1,6-P2，随后参与二次代谢和氨基酸代谢等等。

总之综合多组学分析显示，在枸杞果实成熟过程中，D-葡萄糖作为一种关键代谢物显著积累。这种积累是由一系列基因和酶调节的, LbSPS的显著下调导致蔗糖含量降低。LbGLP、LbGLGC、LbWAXY、LbINV、LbFBP 和LbRS等基因促进了多糖、半乳糖、果糖和总糖的积累。LbF3D和LbBADH的下调导致类黄酮和甜菜碱积累减少。LbGLYA的上调引起代谢物氨基酸含量的增加。

图6 代谢途径中关键DEMs、DEPs和DEGs的调控。(A) MAPMAN中RF与YF的差异分析概述了代谢途径, (B)碳水化合物、次级代谢物和氨基酸代谢途径中的显著富集的关键DEGs、DEPs、DEMs。

此外作者发现转录因子LbNAC与LbSPS显著相关，并利用酵母单杂验证了其确实存在相互结合，双荧光素酶实验也进一步验证了LbNAC直接结合LbSPS的启动子直接激活LbSPS。

图7 LbNAC与LbSPS的启动子结合。A.酵母单杂实验; B.双荧光素酶载体的构建; C.双荧光素酶实验

研究结论

总的来说，这项研究综合利用理化指标测定、代谢组学、蛋白质组学和转录组学的多组学分析来阐明枸杞果实在三个发育阶段的代谢变化，发现随着果实的成熟，半乳糖、果糖和总糖含量的显著增加，甜菜碱和类黄酮含量逐渐减少。经共表达网络分析得出关键基因LbGLP、LbFBP、LbINV、LbRS、LbGLGC和LbWAXY与观察到的半乳糖、果糖和总糖的增加密切相关，其中LbGLGC和LbWAXY之间存在蛋白-蛋白相互作用。LbSPS基因的下调与蔗糖含量降低相关，且转录因子LbNAC与LbSPS启动子直接相互作用。LbF3D和LbBADH基因的显著下调是黄酮类和甜菜碱减少的原因等。该研究揭示了枸杞果实成熟和采后代谢中关键的分子和途径，所鉴定的候选基因具有提高枸杞营养品质和采后性状的育种潜力。