金黄色葡萄球菌感染的治疗是一项持续的挑战，因为对万古霉素产生了耐药性（万古霉素被认为是临床上治疗严重MRSA感染的最后一道防线）。S-亚硝基化是一氧化氮 （NO） 基团与半胱氨酸硫醇的共价连接，介导基于氧化还原的真核细胞功能信号传导。然而，它在细菌中的作用在很大程度上是未知的。

中国科学技术大学在《Nature Communications》期刊发布题为"Transcription tuned by S-nitrosylation underlies a mechanism for Staphylococcus aureus to circumvent vancomycin killing"的文章，通过蛋白质组学分析揭示了在金黄色葡萄球菌中S-亚硝基化的转录调控是 NO 介导的细菌抗生素耐药机制的基础。

研究背景

金黄色葡萄球菌（VISA）是一种主要的人类病原体，可引起多种严重感染，从浅表皮肤感染到危及生命的心内膜炎和败血症。多药耐药性的出现使金黄色葡萄球菌感染成为全球关注的问题，尤其是对万古霉素的耐药性。一氧化氮（NO）可由 NO 合酶 （NOS） 在真核生物中合成，在调节生理和免疫功能中起着重要作用。S-亚硝基化是 NO 介导的半胱氨酸硫醇的翻译后修饰，驱动 NO 对介导细胞功能（如心肌细胞功能障碍、炎症和细胞凋亡）有普遍影响，从而提供了受S-亚硝基化调节的基于氧化还原的细胞信号转导机制的原型。

技术手段

实验材料：临床分离的 VISA 菌株 XN108

实验方法： S-亚硝基化修饰组学、IP、WB

主要结果S-亚硝基化是金黄色葡萄球菌的一个突出生长特征

通过液相色谱-质谱法 （LC-MS）/MS 分析临床分离的 VISA 菌株 XN10826 中的 S-亚硝基化修饰，在302 种蛋白质中鉴定了 484 个独特的 S-亚硝基半胱氨酸残基，占金黄色葡萄球菌基因组中编码的总蛋白质的10.1%。该数据集包括在一些中心过程中发挥作用的蛋白质成分，如能量产生和转化、翻译和核糖体生物发生、转录和调节因子、核苷酸转运和代谢等。这些数据表明 S-亚硝基化是金黄色葡萄球菌生长的一个突出特征。

鉴定转录因子 MgrA 作为 S-亚硝基化的靶标

细菌已经进化出转录因子来感知环境的氧化还原状态，并通过调整基因表达来做出反应，在该项目研究中，作者观察到金黄色葡萄球菌中大部分 （8.9%）的S-亚硝基化蛋白参与转录，所鉴定到的蛋白包括MgrA、WalR、SarR、SarS 和 ArcR等经典的调节因子。这些结果表明存在由 S-亚硝基化驱动的转录调控网络以平衡金黄色葡萄球菌中的亚硝化应激。因此，作者专注于从蛋白质组中所鉴定到的转录调节因子。其中MgrA是一种参与自溶活性、多药耐药性和毒力的全局调节蛋白，被发现在半胱氨酸残基 Cys12 处被 S-亚硝基化。为了验证MgrA是NO的靶标，作者理由WB分别对 WT 型菌株和NOS 敲除 （Δnos）进行检测，结果显示，在野生型 （WT） 菌株中明显检测到 MgrA 的S-亚硝基化，但在NOS敲除 （Δnos） 菌株中未检测到，表明 MgrA 的 S-亚硝基化形成取决于 NOS 产生的 NO，也表明在没有外源NO 的情况下，由NOS产生的NO诱导MgrA发生内源性s -亚硝基化。

图 鉴定转录因子 MgrA 作为 S-亚硝基化的靶标

MgrA的S-亚硝基化以 NO 依赖性方式促进万古霉素耐药性

据报道，MgrA 参与万古霉素耐药性的调节，于是作者于VISA中通过将不能被 S-亚硝基化的丝氨酸替换半胱氨酸残基来进行等位基因替换以生成 mgrAC12S 突变菌株并检测万古霉素的最低抑菌浓度（MIC）以评价 MgrA 的 S-亚硝基化是否影响 VISA 的万古霉素耐药。结果显示，mgrAC12S 突变菌株中万古霉素的 MIC 显著降低（从 8 μg/mL 降至 4 μg/mL），而亲本 VISA 菌株在 6 μg/mL 万古霉素下生长良好，这说明MgrA S-亚硝基化对于万古霉素敏感性的调节很重要。为了进一步评估内源性 NO 对金黄色葡萄球菌万古霉素耐药性的影响，比较了 WT 和 Δnos 菌株在含万古霉素培养基中的生长速率，Δnos 菌株在含有 4 μg/mL 万古霉素的培养基中显示出生长缺陷，在含有万古霉素的平板上进一步评估测定 WT 和突变菌株对万古霉素的敏感性，结果显示mgrAC12S 突变菌株和Δnos 菌株都对万古霉素表现的显著敏感性，且呈浓度依赖性，这些结果说明金黄色葡萄球菌抗性对内源性 NO 水平有很强的依赖性，此外作者还使用 NOS 抑制剂 N^G-硝基-L-精氨酸甲酯 （L-NAME） 来研究抑制 NOS 活性是否会影响金黄色葡萄球菌的万古霉素耐药性，结果显示当加入 2 μg/mL 万古霉素时，WT 菌株的生长速率略有降低，添加 40 mM L-NAME 进一步抑制了这种生长速率，这表明金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药的 NO 水平具有很强的依赖性，且这种效应在VISA 菌株 Mu50中普遍存在。作者还对Δnos 菌株使用L-NAME而Δnos 菌株的生长没有受到抑制，说明L-NAME对金黄色葡萄球菌的生长抑制作用不是由L-NAME本身引起的。这些结果表明VISA 需要 MgrA 的 S-亚硝基化来调节万古霉素耐药性，而万古霉素耐药性取决于内源性 NO。此外作者还通过对Δnos 和 mgrAC12S含有 2 μg/mL 万古霉素的生长培养基中补充有外源 NO 供体硝普钠 （SNP）证明了MgrA S-亚硝基化以 NO 依赖性方式促进万古霉素耐药性；

图 NO 介导的 MgrA S-亚硝基化促进 VISA 对万古霉素的耐药性

图 MgrA 上的 S-亚硝基化需要 NO 以促进万古霉素耐药性

MgrA 的 S-亚硝基化有助于细胞壁厚度和完整性且可通过自溶相关基因驱动转录信号传导VISA 菌株通常显示细胞壁增厚，这可使游离的 D-Ala-D-Ala 残基增加对万古霉素分子的捕获，从而保护细胞免受万古霉素杀伤。因此，作者通过透射电子显微镜 （TEM） 研究了 MgrA S-亚硝基化在确定细胞壁厚度中的作用。结果显示WT 菌株的细胞壁平均厚度为 61.35 ± 2.96 nm，而 mgrAC12S 突变体的细胞壁明显较薄（44.93 ± 2.87 nm，p < 0.0001），Δnos 细胞的细胞壁厚度也减少 （51.57 ± 1.84 nm，p = 0.0001），其与 WT 间的差异并不像 mgrAC12S 突变菌株那样明显。因此，这些结果表明 MgrA中 Cys12 的 S-亚硝基化对于维持均匀的细胞壁厚度有重要作用。

作者对WT 和 mgrAC12S 突变菌株中进行 qRT-PCR 分析，以测量 sarV、lytN 和 altA的表达以探讨了 MgrA S-亚硝基化对金黄色葡萄球菌自溶的影响是否是由于自溶相关基因表达的功能控制造成的。结果表明MgrA S-亚硝基化通过促进参与自溶的基因的转录抑制来负向调节金黄色葡萄球菌的自溶。作者对WT 和 mgrAC12S 突变菌株用 0.2 或 1 mM SNP 处理并用qRT-PCR 分析以研究 NO 是否通过 MgrA 的转录调控传达万古霉素耐药信号，结果表明从 MgrA Cys12 中去除 S-亚硝基化严重损害了 NO 介导的 lytN 和 sarV 转录调控信号转导。为了确定MgrA中单个残基的s -亚硝基化和s -氧化是否控制不同的信号通路，作者使用H₂O₂ 氧化MgrA中的Cys12，并测量了对WT和mgrAC12S菌株lytN和sarV表达的影响，结果表明H2O2 介导的 MgrA 的 S-氧化和 NO 介导的 MgrA 的 S-亚硝基化可能驱动不同的调节途径，等。

图 VISA通过调节细胞壁厚度和细胞自溶来实现 MgrA 对万古霉素抗性的氧化还原信号转导

WalR 的 S-亚硝基化赋予万古霉素耐药性

此外，作者想验证其它S-亚硝基化转录调节因子是否也可能导致 VISA 中的万古霉素耐药，以及 S-亚硝基化介导的机制是否可以推广到其他调节因子。WalR 是双组分调节系统 WalKR 的反应调节因子，据报道可调节金黄色葡萄球菌的自溶和细胞壁代谢，在 Cys67 位点被鉴定为 S-亚硝基化。Cys67 位于接受来自同源组氨酸激酶 信号的接收结构域中 WB实验也检测到 WalR 的 S-亚硝基化，在 WT 菌株中明显检测到 S-亚硝基化 WalR，但在 Δnos 菌株中未检测到，表明 WalR 的 S-亚硝基化形成取决于 NOS 产生的 NO。为了确定 WalR S-亚硝基化是否调节金黄色葡萄球菌中的万古霉素耐药性，生成 WalRC67S 菌株并测量万古霉素的MIC，结果与在 MgrAC12S 突变体中观察到的结果类似，WalRC67S 突变菌株表现出万古霉素 MIC 从 8 μg/mL 显著降低至 4 μg/mL，这与之前的发现一致，即 WalR 在调节万古霉素耐药性中发挥作用。WalRC67S 突变菌株在含有万古霉素的平板上也表现出明显的生长缺陷。这些数据表明，WalR 中 NO 介导的 S-亚硝基化也增强了 VISA 表现出万古霉素耐药性。

研究结论

总的来说，该研究证明了内源性 S-亚硝基化是调节金黄色葡萄球菌万古霉素耐药性的关键机制，也是未来细菌研究的重要领域。VISA 使用一种涉及转录调节因子（如 MgrA 和 WalR）的机制来感应内源性 NO，导致 S-亚硝基化并诱导转录信号以规避万古霉素杀伤. 该研究为 VISA 和其他抗生素耐药病原体的临床治疗提供了有价值的见解。