一、研究背景

1、大骨节病（Kashin-Beck disease ，KBD）是一种地方性的慢性变形骨关节病，在中国、朝鲜、俄罗斯等地具有较高的患病率和发病率，成年的患者很难治愈，并且会逐渐出现与骨关节炎（Osteoarthritis ，OA）相似的症状，目前，大骨节病的确切病因和病理机制尚不清楚。2、目前，蛋白质组学已被用于检测差异表达蛋白及其在细胞和组织中的相互作用。蛋白质的功能受到多种因素的调节，包括翻译后修饰（posttranslational modifications，PTMs）。糖基化修饰，尤其是N-糖基化，是蛋白质翻译后修饰的重要组成之一，与OA的进展相关。

二、研究手段

分别取9例KBD（50-68岁，Ⅰ或Ⅱ级）和OA（51-68岁）患者的软骨样本，进行蛋白质提取并消化，TMT标记并分离，富集N-糖基化肽段后，进行蛋白质组学和N-糖基化蛋白质组学分析。

图1  技术路线

三、研究结果

PCA和OPLS-DA分析显示KBD和OA之间存在异质性和同质性。PCA无监督分析提供了一个具有两个组成部分的模型，解释了68.6%的蛋白质组学结果和72.1%的N-糖蛋白质组学方差（图2 A，B），OPLS-DA监督分析展示组间具有良好的分离（图2 C,D）。在KBD和OA样本中共鉴定出2205个蛋白，与OA样本相比，KBD中有121个蛋白显著上调， 254个下调(图2E)。N -糖基化蛋白质组学分析显示，KBD和OA样本中共鉴定出278个N-糖基化位点，其中150个位点显著下调(图2F)。

图2 KBD和OA的同质性和异质性

2、KBD和OA差异蛋白及N-糖基化分析

N-糖基化蛋白组学分析显示，KBD存在66个N-糖基化位点(KBD特有)，并被定义为上调位点，这些位点与61个蛋白相关，在N-糖蛋白组学中被定义为上调蛋白（图3A）。对蛋白组学中的所有蛋白（共2205个）与N-糖基化蛋白质组学中显著位点的相关蛋白(共187个)进行比较分析，发现 46个共有蛋白(图3B)；与61个KBD独有的N-糖基化位点相关蛋白相比，发现11个共有蛋白(图3C)；与54个OA特有的N-糖基化位点相关蛋白相比，含14个共有蛋白(图3D)；与N-糖基化蛋白组学分析中98个下调的N-糖基化位点相关蛋白相比，发现32个共有蛋白(图3E)。相关蛋白详见表1。

图3 KBD和OA蛋白质组及N-糖基化蛋白质组相关蛋白分析

表1

3、KBD和OA蛋白质组及N-糖基化蛋白质组的GO富集分析

对KBD及OA蛋白质组学和N-糖基化蛋白质组学分析结果进行GO富集分析。生物过程的结果显示，蛋白质组学和N-糖基化蛋白质组学共享有8条相关通路，涉及对损伤的反应、发育过程、单细胞发育过程等（图4A,B）。细胞成分中共享10条通路，包括细胞外区域部分、膜结合囊泡、囊泡、细胞外区域、细胞外基质（ECM）等（图4C,D）。分子功能的结果显示，细胞外基质结构组成、钙离子结合为共有通路（图4E,F）。

图4 蛋白质组及N-糖基化蛋白质组相关蛋白GO富集分析

4、KBD和OA蛋白质组及N-糖基化蛋白质组的KEGG富集分析

KEGG通路分析显示，22条通路在蛋白质组学分析中显著富集，包括代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、有机体系统和人类疾病(图5A)。在N-糖蛋白组学分析中，11条通路显著富集,包括代谢、环境信息处理、细胞过程、人类疾病和未知类别(图5B)。蛋白质组学和N -糖基化蛋白组学的前20个KEGG通路中，共有的KEGG通路有4条，分别是ECM受体相互作用、焦点粘连、吞噬体及蛋白质消化吸收(图5C)。

图5 蛋白质组及N-糖基化蛋白质组相关蛋白KEGG富集分析

四、结论

结果表明，蛋白ITGB1、LRP1、AON6、COL1A1、MXRA5、DPP4、CSPG4及其N-糖基化位点与KBD的病理过程相关，而CRLF1和GLG1与大骨病和OA均相关。GO注释显示细胞外囊泡可能在KBD和OA的发生中发挥重要作用。KBD和OA的关键途径包括ECM受体相互作用、焦点粘连、吞噬体、蛋白质消化和吸收。这一信息为蛋白质N-糖基化在KBD和OA中的作用提供了实质性的见解，也为未来研究KBD和OA及其他软骨疾病的发病机制提供新的思路。

编辑：Miao.D

审核：Tao Li

参考文献

Lyu Y, Deng H, Qu C, Qiao L, Liu X, Xiao X, Liu J, Guo Z, Zhao Y, Han J, Lammi MJ. Identification of proteins and N-glycosylation sites of knee cartilage in Kashin-Beck disease compared with osteoarthritis. Int J Biol Macromol. 2022 Jun 15;210:128-138.