先天性心脏病 （CHD） 的产前诊断主要依赖于胎龄中期的胎儿超声心动图检查，但其敏感性有极大的个体差异性，急需另一种更客观的早期诊断方法。

上海交通大学在《EMBO Molecular Medicine》期刊发布题为"Proteome profiling of early gestational plasma reveals novel biomarkers of congenital heart disease"的文章，对有和没有 CHD 胎儿的妊娠早期孕妇的血浆蛋白进行蛋白质组学分析以寻找可靠的新生物标志物。

研究背景

先天性心脏病 （CHD） 是新生儿中最常见的先天性畸形，是全球最常见的出生缺陷类型, 具有高发病率和死亡率，给患者、家庭和社会带来巨大的负担, 早期诊断对于改善CHD的预防和治疗至关重要。现有的产前诊断方法主要依赖于中孕期进行的胎儿超声心动图，但该法的检测敏感性受不同的检测中心和操作者的影响，且心脏异常在常规产前护理中仍然容易被忽视。目前识别生物标志物的进展仍无法满足对改进早期诊断CHD生物标志物的迫切需求，因而迫切需要开发新的方法来提高早期诊断CHD的准确性。在该研究中作者通过对妊娠早期孕妇血浆蛋白质组进行分析以全面识别可靠的CHD诊断生物标志物。

技术手段

实验设置：组1:67例子有CHD新生儿的母亲血浆+71例健康新生儿的母亲血浆；组2：37例有CHD新生儿的母亲血浆+32例健康新生儿的母亲血浆。（共103例健康新生儿的母亲和104例有CHD新生儿的母亲的血浆）实验方法：DIA蛋白质组

主要结果

母体血浆的蛋白质组学特征

在组1和组2中分别鉴定了8624和7049个蛋白质，主成分分析（PCA）显示两组病例和对照之间存在明显差异，表明在妊娠早期，患有CHD胎儿的孕妇表现出与携带健康胎儿的孕妇不同的血浆蛋白质组学特征。组1 的差异蛋白有397个，其中在CHD组中显著上调84个，显著下调213个；组2的差异蛋白有225个，其中在CHD组中显著上调80个，显著下调145个。这些DEP包括几种先前确定的血浆CHD标志物，如神经纤毛蛋白-2、ATP-柠檬酸合酶（ACLY）、蛋白S100-A7（S100 A7）、肌球蛋白调节轻链多肽9（MYL 9）、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶（G6 PD）、丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT 1）、类辅肌动蛋白（COTL 1）和纤溶酶原激活物抑制剂1（SERPINE 1）。作者利用WB进一步验证了蛋白质组学的结果，证实患有CHD后代的孕妇血浆样品中G6PD和SHMT1的表达降低，MYL9的表达增加。

蛋白质的功能富集分析发现在两组中，CHD组中264个显著上调的蛋白质主要富集在氨基酸代谢、细胞外基质（ECM）受体、肌动蛋白骨架调节、Ras‐MAPK信号通路和PI 3 K ‐Akt信号通路中。相反，358个显著下调的蛋白质与碳水化合物代谢、心肌收缩和心肌病密切相关。此外，为了了解各种上调和下调蛋白质中的分子途径关系，作者对改变的蛋白质进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，揭示每个途径中的关键分子，结果表明，CHD胎儿孕妇血浆中表达大量与胚胎器官发育相关的蛋白质，与健康胎儿相比差异显著，这些显著改变的蛋白质有可能作为疾病的生物标志物。

图 两组中CHD与对照组血浆蛋白质组的差异

两组中8种已知CHD相关蛋白的表达水平均发生一致变化，包括热休克蛋白HSP90-α（HSP90AA1）、苹果酸脱氢酶（MDH2）、MYL9、ACLY、N-乙基马来酰亚胺敏感因子（NSF）、α-原肌球蛋白基因（TPM）、SERPINE 1和补体因子H相关2（CFHR2）。CHD组HSP90AA1、MDH2、MYL9和ACLY蛋白表达水平均高于对照组。相比之下，CHD组中NSF、TPM1、SERPINE1和CFHR2的蛋白表达水平低于对照组。这些结果表明，母体血浆中表达的蛋白质与心脏发育相关。此外，CHD和对照血浆之间的74种蛋白质水平的变化在组1和组2之间是一致的，两组中总共有25种蛋白质显著上调，49种蛋白质显著下调，作者进一步分析了这74个DEPs，发现25个上调蛋白主要参与代谢、先天免疫应答和细胞周期途径，而49个下调蛋白主要参与葡萄糖代谢、脂质代谢和血管相互作用等过程, 这些途径可能是胎儿心脏发育所必需的。

图 两组血浆蛋白质组的变化

CHD蛋白共表达网络的构建与验证

为了进一步确定CHD病理学的潜在驱动因素，作者进一步选择了2280个蛋白质做加权基因共表达网络分析（WGCNA）生成蛋白质共表达网络。作者观察到有6个模块与临床表型簇显著相关。聚类1与蛋白质模块4和8显著相关，并在碳水化合物代谢、谷胱甘肽代谢和免疫应答中富集。簇2与蛋白模块9和10显著相关，并富集ECM受体应答、蛋白转运和信号转导。簇3与蛋白质模块2和3显著相关，并且主要富集于心肌生长、发育的调节和肌动蛋白细胞骨架的调节。为了进一步研究不同集群中影响疾病发生的潜在因素，作者分析了PPI网络的通路，发现如淀粉酶α2A（AMY2A）、免疫球蛋白λ样多肽5（IGLL5）、MYL9、整联蛋白亚基α1（ITGA1）、RAS癌基因家族成员（RAB6A）和连环蛋白β1（CTNNB 1）是各途径的关键因子，这些枢纽蛋白可以将CHD与对照组区分开来。

此外，作者研究了10个蛋白模块与18个临床指标之间的关系，发现只有三个模块（M2，M3和M6）与CHD病理学表现出强相关性。其中M2,M3与血脂、甲状腺正相关，这说明血脂和甲状腺激素水平的增加可能是CHD的危险因素。此外，M6水平与甲状腺激素水平呈负相关。作者还通过不同组间的脂质浓度分析发现脂质是CHD的主要危险因素，说明脂质波动可能与CHD的发生有关。

_{图 先天性心病血浆蛋白质组学与临床表型及指标的关系}

CHD的免疫景观

研究使用xCell工具基于蛋白质组数据生成了细胞类型免疫富集评分，发现了与免疫（如CD4+ T细胞和NK细胞）或基质（如脂肪细胞和内皮细胞）特征相关的21种不同细胞类型。活化的CD4+ T细胞可以释放促炎细胞因子以激活巨噬细胞和血管细胞并引起急性炎症。它们还可以引起慢性炎症状态，这可能进一步损害心脏发育。

基于机器学习的CHD生物标志物验证

基于第1组的血浆蛋白质组学数据，作者选择了钙蛋白酶-5（CAPN5）、烯醇化酶-磷酸酶E1（ENOPH1）、组蛋白H2A 1-C型（H2AC6）、HSP90AA 1、输入蛋白亚基β-1（KPNB1）、MDH2、MYL9、根蛋白（RDX）和SAMHD1利用机器学习方法来识别潜在的生物标志物组合，以识别妊娠早期女性的CHD胎儿，结果显示这些蛋白对于识别CHD和对照组具有较高的准确性和分类能力，具有生物标志物的潜力和能力。

图 利用机器学习验证生物标志物组合来预测CHD

研究结论

总的来说，该研究确定并验证了一种包含9种蛋白质的生物标志物组合可作为母体检测胎儿CHD的新型非侵入性生物标志物。这将有助于有针对性地使用医疗资源。此外，该项工作为研究界提供了非常有价值的蛋白质组学资源，以更好地了解CHD的病因，确定一系列有价值的生物标志物候选者，并为潜在的治疗策略提供线索。