双特异性T细胞衔接器（bispecific T-cell engager，BiTE）是一种能够同时结合肿瘤相关抗原（tumor associate antigen， TAA）和 CD3 复合物的抗体类抗肿瘤药物。传统的技术是通过靶向TAA 来实现肿瘤内T细胞上CD3信号通路的再激活，从而达到靶向杀伤肿瘤细胞的效果。自上世纪90年代起，针对双特异性抗体疗法的设计和改进已经有了近30年的研究。然而，目前为止只有安进公司（Amgen）的Blinatumomab (针对CD19 的 BiTE) 被FDA 批准用于治疗复发或难治性急性淋巴细胞白血病 (acute lymphoblastic leukemia, ALL) 。但是，以细胞因子风暴（cytokine storm）为主的严重的副作用及半衰期短，TAA特异性低和免疫抑制性肿瘤微环境等因素都极大的限制了 BiTE在体内的抗肿瘤效应。其针对实体瘤的临床测试结果尤其不佳。因此，提升双特异性抗体的有效性并降低其副作用能够极大的促进该疗法在临床的广泛应用。

在肿瘤组织里，免疫检验点PD-L1在肿瘤细胞和多种免疫细胞表面均有表达，并发挥抑制T细胞功能的作用。因此，靶向PD-L1来激活T细胞不仅能实现更有效的肿瘤靶向，而且可以阻断PD-L1/PD-1的相互作用，从而避免T细胞在杀伤肿瘤过程中产生耗竭。

为了验证这一假设，研究团队首先制备并验证了双特异性抗体（PD-L1xCD3）能够同时结合PD-L1和CD3ε，并能够以PD-L1依赖的方式刺激T细胞活化并分泌IFNγ，杀伤肿瘤细胞。体内实验进一步表明PD-L1xCD3能够在MC38模型上产生良好的抗肿瘤效果。通过细胞过继转移和删除实验表明，PD-L1xCD3能够诱导抗原特异性CD8 T细胞反应并产生免疫记忆，而这一现象依赖于肿瘤内预存的CD8 T 细胞。

为了研究PD-L1xCD3是否比传统的TAAxCD3具有更强的抗肿瘤效果，作者们制备了靶向TAA（EGFR）的ErbxCD3双特异性抗体，并通过体外实验证明其具有与PDL1xCD3相似的亲和力，激活T细胞能力和肿瘤细胞杀伤能力。然而体内实验却表明，在相同剂量下PD-L1xCD3比ErbxCD3展现出了更强的抗肿瘤效果，并且这一现象在TC1，B16F10，TuBo等多种肿瘤模型上均得到了验证，提示靶向免疫检验点PD-L1的双特异性抗体比靶向TAA具有更好的激活T细胞能力。

为了进一步探究产生这种区别的机制，作者们首先通过在不同的细胞上敲除了PD-L1来探寻哪种细胞表达的PD-L1对于PD-L1xCD3在体内的抗肿瘤效果是必须的。出乎意料的是，尽管肿瘤细胞本身是最主要的PD-L1阳性的细胞，但敲除肿瘤细胞上的PD-L1并没有影响PD-L1xCD3的治疗效果。与之相反，敲除宿主细胞上的PD-L1却彻底废除了PD-L1xCD3的治疗效果。利用条件性PD-L1敲除小鼠进一步验证了树突状细胞而并非巨噬细胞表达的PD-L1起到了至关重要的作用。利用Batf3敲除小鼠作者确认，树突状细胞亚群（cDC1）对于PD-L1xCD3的治疗效果是不可或缺的。

前期研究表明，anti-PD-(L)1 治疗能够通过增强B7-1(CD80) 与CD28的相互作用来达到激活T 细胞的效果。由此，研究人员提出了PD-L1xCD3治疗是通过增强共刺激信号来发挥作用的假设。结果也表明，用抗体阻断CD80/86后，PD-L1xCD3的治疗效果消失同时抗原特异性T细胞反应也大大减弱。通过体外实验进一步证明，PD-L1xCD3能够通过增强共刺激信号的方式促进IL-2的分泌，避免T细胞因过度激活导致的凋亡，从而实现肿瘤内T细胞的长效激活。

图：PD-L1xCD3的作用机理

传统BiTE的设计理念是通过单链抗体（ScFv）衔接T细胞与肿瘤细胞，促使T细胞活化并直接进行肿瘤细胞杀伤。然而，在肿瘤微环境里T细胞的数量和质量都非常有限。而肿瘤细胞不仅数量“占优”并且能够通过激活抑制性信号通路（如PD-L1/PD-1）来逃逸杀伤。与此同时，由于肿瘤细胞本身并不表达共刺激分子，其激活T细胞的效果非常有限。面对数倍于己的“敌军”，T细胞在反复杀伤的过程中很容易产生耗竭而败下阵来。与之相反，作为新型双特异性抗体，PD-L1xCD3能够将T细胞与树突状细胞衔接在一起，从而为其激活提供充足的条件（共刺激分子）。通过与树突状细胞的相互作用，T细胞不仅得到了有效的激活并且能够通过IL-2实现自我扩增。最终实现T细胞的持续性激活并获得持久的抗肿瘤免疫反应。

综上所述，该研究为新一代双特异性抗体设计提供了思路。证明了PD-L1xCD3 具有优于传统BiTE的如下特点：1）靶向肿瘤组织降低毒性；2）阻断PD-L1/PD-1相互作用，解除T细胞抑制；3）靶向树突状细胞为T细胞激活提供共刺激信号，从而促进IL-2介导的T细胞存活。

据悉，该论文已被选为《自然—生物医学工程》杂志11月份的封面故事。

相关论文信息：

https://www.nature.com/articles/s41551-021-00800-2