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论文赏析：结直肠癌早期诊断 粪便DNA的SDC2甲基化检测技术及其临床评价
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结直肠癌早期诊断——粪便DNA的SDC2甲基化检测技术及其临床评价
一、引言
本研究的目的是开发一种基于粪便样本DNA的 SDC2甲基化检测技术，用于结直肠癌的早期诊断并对其临床价值进行评价。
二、方法
本方法以粪便为样本，提取DNA，经过亚硫酸盐处理后进行两轮PCR反应。第一轮PCR富集SDC2靶标（LTE），第二轮PCR对SDC2进行甲基化特异性PCR（qMSP）检测，合称为meSDC2 LTE-qMSP分析（线性靶向富集甲基化特异性实时定量PCR法）。
（一）研究设计、研究群体和临床研究程序
序号 | 步骤 | 内容 |
1 | 研究目的 | 评价粪便SDC2甲基化检测方法及其在肠癌诊断中的效果 |
2 | 临床设计 | 回顾性病例和前瞻性对照 |
审批程序 | ||
3 | 临床审批 | 医院机构审查委员会批准。 |
4 | 知情同意 | 受试者提供书面知情同意书。 |
5 | 临床注册 | 临床试验在网站http://www.clinaltrials.gov注册并获得注册号 |
样本设计 | ||
6 | 纳入标准 | 30-80岁的合格受试者 |
7 | 排除标准 | 既往有大肠癌病史、化疗或放疗史或信息不完整的受试者 |
8 | 采样方法
| 前瞻性对照样本：结肠镜肠道准备前1天（或更早）采集粪便样本 |
回顾性病例样本：确诊为结直肠癌和其他胃肠道癌症的患者，在手术治疗前一天（或更早）采集粪便样本 | ||
9 | 样品信息 | 年龄、性别、临床诊断、息肉数量和大小、组织学亚型和粪便样本收集日期。 |
11 | 评价指标 | meSDC2-LTE-qMSP结果、结肠镜检查结果和病理结果 |
12 | 病理分级
| 晚期腺瘤（AA，≥1.0 cm）、非晚期腺瘤（NA，<1.0 cm）、增生性或其他息肉（HOP）和无疾病迹象（NED，结肠镜检查阴性结果） |
（二）粪便收集、DNA提取和亚硫酸氢盐处理
序号 | 步骤 | 内容 |
1 | 粪便取样 | 至少2g粪便 |
2 | 粪便DNA保护液 | 20毫升 |
3 | 粪便DNA提取 | 取 1~2 g粪便样品在粪便保存液中用多旋涡混合器混匀后，进行提取。 |
4 | DNA浓度测定 | 使用Qubit ds DNA-BR分析试剂盒进行 |
5 | DNA转化 | 使用EZ DNA甲基化转化试剂盒进行，转化后DNA立即用于PCR分析，或者在-20°C下保存 |
（三）meSDC2 LTE qMSP方法的性能测定
序号 | 步骤 | 备注 | |
1 | 检测仪器 | Rotor Gene Q PCR仪 | |
2 | 性能指标 | 检测特异性，灵敏度，最低检测限，再现性、可重复性和批间差 | |
3 | 检测限分析（LoD） | 阴性DNA | 收集20名健康个体的粪便，提取DNA，经LTE-qMSP检测证实为SDC2甲基化阴性 |
阳性DNA | HCT116细胞系基因组DNA（完全甲基化的人类基因组DNA） | ||
阳性梯度DNA | 在2.0μg 阴性粪便DNA中加入不同量（20、2、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01和0 ng）的阳性细胞系DNA | ||
PCR检测 | 每种浓度DNA重复检测24次 | ||
计算检测限 | 24次重复中，95%为阳性所对应的浓度为检测限。 | ||
4 | 精确度评估（CV） | 精确度 | Ct值的变异系数 = 标准差（SD）/平均值 |
PCR模板 | 两种甲基化浓度的DNA（0.5 ng和0.1 ng） | ||
再现性 | 每种浓度重复2次，2个地点，连续5天PCR测试 | ||
重复性 | 每种浓度重复2次，连续20天PCR测试 | ||
批间差 | 每种浓度重复2次，连续5天PCR测试 | ||
5 | PCR特异性评估 | 模板 | 0.5 ng HCT116-DNA和20 ng SDC2甲基化阴性DNA，分别加入105至106个拷贝的白色念珠菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌，人类巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型和乙型肝炎病毒DNA。 |
特异性 | 对含有靶标的DNA出现扩增，其他不扩增 | ||
6 | 干扰物的影响评估 | 模板DNA | 甲基化SDC2阳性+粪便阴性样品+ 23种潜在干扰物质（根据临床应用和饮食习惯选择）。 |
评估 | 评估干扰物对检测性能的影响 | ||
干扰物清单列于表1（略）
PCR方法评价依据：McEnroe RJ, Durham AP, Goldford MD, Kondratovich MV, Lababidi S, Magari R, et al. Evaluation of precision of quantitative measurement procedures; approved guideline-3rd Ed. 2014. pp. EP05–EPA3. [Google Scholar] [Ref list]
（四）PCR检测方法 —— meSDC2 LTE qMSP
步骤 | 内容 |
检测靶标 | SDC2的甲基化 |
内控基因 | COL2A1（以无CpG区域设计引物） |
模板DNA | 亚硫酸氢盐修饰的DNA |
第一轮PCR体系 | 反应体系20μL：含2.0μg转化后的粪便DNA、SDC2和COL2A1引物对各50 nmol/L， 4μL 5x AptaTaq PCR主混合物。 |
第一轮PCR温度 | 95℃5min，95℃15s，60℃60s，循环35次 |
第二轮PCR体系 | LTE后，将反应混合物体积扩大至40μL，包含8μL 5xAptaTaq PCR主混合物、250 nmol/L SDC2甲基化特异性引物、125 nmol/L SDC2探针、125 nmol/L COL2A1探针、62.5 nmol/L COL2A1探针和250 nmol/L通用序列引物。 |
第二轮PCR温度 | 95°C 5 min，然后进行40次95°C 15 s和60°C 60 s的循环。 |
质量控制 | 内控基因HCT116，阴性对照（全基因组扩增的人类淋巴细胞DNA）；阳性对照。 |
重复 | 2次 |
控制标准 | 当COL2A1的Ct值≤ 31时，试验合格。如果未检测到COL2A1或其Ct值大于31，则需要重新测试。 |
阳性截断值 | Ct值<40 |
结果判定 | 2次重复只要有一个为阳性，样本就判为阳性；两次重复都为阴性则判为阴性。 |
（五）统计分析
样本量计算 | PASS 13.0程序（NCSS，美国）：结直肠癌患者241例，NED患者241例 |
样本设计 | 268名大肠癌患者、268名NED受试者（预计样本丢失率为10%）、结直肠息肉（n = 67）、胃癌（n = 23）和肝癌（n = 12）患者 |
样本量估计无效假设 | （I）敏感性高于70%；（ii）特异性高于80%。第一类错误单尾概率为0.025，保证每增加10%的检出率，效能不低于90%。 |
敏感性和特异性 | 设甲基化阳性为“1”，甲基化阴性为“0”，肠镜结果为金标准。 敏感度（%）=真阳性/RCC患者总数×100 特异性（%）=真阴性/受试者总数×100 |
性能参数 | ROC曲线下面积AUC值及其95%可信区间（CI）。 |
统计分析 | SAS V9.4软件完成 |
（六）样本入组流程图
三、结果
meSDC2 LTE-qMSP 方法的测试性能
表 2以甲基化阳性细胞系HCT116为样本检测SDC2甲基化的最低检出限估计
甲基化浓度0.01%时 (相当于 3个体细胞基因组，即10 pg)，从24次重复检测中出现13次阳性，阳性率54.2%（平均Ct值=30.39），说明此浓度低于检出限。甲基化浓度0.05%时 （50pg），阳性率 95.8% (23/24) （平均Ct值=28.62）。分析显示，95% LoD检出限是 34.5 pg (95% CI 18.6–64.1 pg)，即 20个体细胞基因组，相当于0.104% (图. 2)。
图2检测限分析（数据来自表2，分析采用Probit法进行）。Y轴是SDC2甲基化阳性率，而X轴是甲基化浓度（在总共2.0μg SDC2甲基化阴性粪便基因组DNA中添加HCT116基因组DNA）。箭头表示检出限LoD值=34.5 pg。
表3 PCR检测方法精密度分析结果
不同研究群体的甲基化水平比较
图3是两次反应的粪便DNA SDC2甲基化分析结果
SDC2甲基化的分布：每个样本的甲基化水平用40-Ct表示。如果检测不到SDC2甲基化信号，则记为0。CRC表示结直肠癌（0-IV期）、HOP表示增生性或其他息肉、NA表示非进展性腺瘤（<1.0 cm）、AA表示进展性腺瘤（≥1.0 cm）、GC=胃癌、LC=肝癌、NED=无疾病证据
表4本研究评估过的人口学特征一览表
表5不同类型患者粪便DNA的SDC2甲基化阳性率
粪便DNA-PCR技术的临床评价
在结直肠癌和腺瘤患者粪便样本中， SDC2异常甲基化的频率和水平均高于NED患者（图3）。根据试验结果和ROC曲线分析，阳性截断值定为Ct=40（图4a），此时，总体敏感性为90.2%，AUC为0.902。 癌症分期、肿瘤部位、性别或年龄，敏感性无显著差异（P＞0.05）。进展性和非进展性腺瘤的检出率分别为66.7%（2/3）和24.4%（10/41）。
对于增生或其他息肉（<1.0cm），SDC2甲基化的检出率为26.3%（5/19），与非进展性腺瘤的检出率相似。胃癌和肝癌的SDC2甲基化检出率分别为30.4%（7/23）和30（3/10）（表4）。对于245名结肠镜检查结果完全阴性的受试者，特异性为90.2%（图4b）。
图4A. 癌症与对照的ROC分析图，B. 肠癌分期对应的阳性率及其敏感性
粪便含有脱落的上皮细胞、食物和细菌以及各种PCR抑制剂，导致粪便样本DNA很难进行PCR扩增。为了提高PCR检测敏感性，本研究采取两步PCR扩增法，建立了粪便DNA的meSDC2 LTE qMSP方法[Clin Epigenetics. 2017 Dec 4;9:126. doi: 10.1186/s13148-017-0426-3. eCollection 2017]，每个样本重复检测两次以提高检测敏感性（如果受试者的两个PCR反应中至少有一个呈阳性，则该试验被视为阳性）。据此，meSDC2 LTE qMSP试验对结直肠癌（0–IV）的总敏感性为90.2%，特异性为90.2%。大肠癌早期和晚期的敏感性无显著性差异。对于胃癌患者， SDC2甲基化检出率为30.4%。
文献来源
Yoon Dae Han,1 Tae Jeong Oh,2 Tae-Ha Chung,3 Hui Won Jang,3 Youn Nam Kim,4 Sungwhan An,2 and Nam Kyu Kim
1Early detection of colorectal cancer based on presence of methylated syndecan-2 (SDC2) in stool DNA，Clin Epigenetics. 2019; 11: 51. doi: 10.1186/s13148-019-0642-0
https://blog.sciencenet.cn/blog-3419762-1283087.html
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