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论文赏析：DNA甲基化和影像学特征相结合的肺部结节恶性诊断模型
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题目：DNA甲基化和影像学特征相结合的肺部结节恶性诊断模型
背景：早期发现肺癌可降低肺癌的死亡率。然而，在临床上利用低剂量CT（LDCT）诊断肺部结节的良性和恶性并不容易。本研究试图通过DNA甲基化标记物和影像学特征相结合建立预测模型，来鉴别肺部结节的良性和恶性。
一、材料和方法
（一）伦理学审批
所有受试者在采血前均签署知情同意书，试验前获得医院的医学伦理委员会批准。
（二）患者队列和研究设计
设计号 | 设计参数 | 设计描述 |
1 | 研究对象 | 110例肺部结节患者 |
2 | 样本 | 血样 |
3 | 纳入标准 | （1）受试者在CT扫描中发现肺结节。（2） LDCT得出的结节直径在4到35毫米之间；（3）参与者的临床信息应完整。 |
4 | 排除标准 | （1）妊娠或哺乳期；（2）当前肺部感染；（3）6个月内手术；（4）1年内放疗；（5）预期寿命<1年。 |
5 | 金标准 | CT检查 |
6 | 一般特征 | 年龄、性别、吸烟行为（吸烟状况、吸烟年限、戒烟年限）和癌症史。 |
7 | 影像学特征 | 结节的最大横径、位置和结节类型（非实性或毛玻璃样混浊、裂隙周围、部分实性、实性和毛刺） |
8 | 生物标志物 | PTGER4、RASSF1A和SHOX2甲基化 |
三、样品收集和储存
项目 | 内容 | |
1 | 样本类型 | 血浆样本 |
2 | 样本信息记录 | 样本采集表 |
3 | 采样装置 | 5毫升K2EDTA抗凝管 |
4 | 采样量 | 5毫升外周血 |
5 | 样本储存运输 | 遵循核酸提取试剂盒说明书 |
四、DNA分离与亚硫酸氢盐转化
步骤 | 操作事项 | 技术细节 |
1、
| 收集血浆 | 收集血样标本后在4小时内完成预处理：在4°C下以3000 g离心10分钟，收集血浆到新的试管中，并在80°C下储存，直到使用。 |
2 | 血浆DNA提取 | 利用磁珠法从2毫升血浆中提取循环DNA； |
3 | 转化 | 通过亚硫酸氢盐反应将DNA中未甲基化的C残基转化为U残基。 |
4、 | 洗脱 | 进一步纯化后，将亚硫酸氢盐转化的DNA（bisDNA）用35μL洗脱 |
5 | 甲基化PCR分析 | 洗脱后的转化DNA用于实时PCR分析。 |
五、DNA甲基化分析
序号 | 内容 | 参数 |
PCR反应体系 | ||
1 | 模板DNA | 亚硫酸氢盐转化后的DNA |
2 | DNA提取试剂盒 | Excellen Medical Technology Co.，Ltd. |
3 | PCR总体积 | 25μL |
DNA模板 | 10μL。 | |
引物混合物 | 2.5μL | |
反应缓冲液 | 12.5μL | |
4 | 仪器 | Applied Biosystems 7500快速实时PCR系统 |
PCR质量控制 | ||
5 | PCR重复次数 | 每份样品重复3次 |
6 | 阳性对照 | 体外甲基化白细胞DNA |
7 | 阴性对照 | 正常白细胞DNA或来自已知非甲基化细胞系的DNA |
8 | 空白对照 | 水空白 |
9 | 内参基因 | ACTB |
10 | 荧光通道 | FAM、HEX、Texas-red和CY5 |
11 | 靶基因 | PTGER4,RASSF1A,SHOX2 |
12 | PCR温度设置 | 98°C 5分钟，然后在95°C下45个循环10秒，在63°C 5分钟到58°C 30秒。 |
PCR数据处理 | ||
13 | 有效值判定 | ACTB的Ct值符合灵敏度与可重复性要求（如Ct小于45） |
14 | 平均Ct值 | 用3次重复的数据分别计算靶基因和内参基因的平均Ct值 |
15 | 甲基化水平ML | 计算ML=2-ΔCt，其中（-ΔCt=Ct靶基因-Ct内参基因） |
六、统计分析
步骤 | 备注 |
研究目的 | 构建甲基化与影像学结合的预测模型并评价模型对肺部恶性结节的诊断效果（如AUC值，特异性，敏感性）。 |
对照模型 | 血浆DNA标志物和Mayo临床模型 |
机器学习算法 | K近邻（KNN）、随机森林（RF）、支持向量机（SVM）和logistic回归（LR）算法 |
特征变量 | DNA甲基化状态和相关临床变量 |
数据准备 | 将训练集数据随机分成4等份 |
构建分类器 | 进行4次迭代，每次迭代先将训练数据的3/4用于构建分类器 |
分类器预测 | 用构建好的分类器对剩下的1/4训练数据进行预测分析。 |
ROC分析 | 将4次迭代的预测结果（如模型输出值）进行组合，并与真值（恶性结节与良性结节）进行比较，通过ROC分析计算AUC值，分别评估每个模型的预测能力。 |
分类器验证 | 最后，将从整个训练集中训练出来的分类器应用到一个独立的样本中，独立地验证了预测能力。 |
评价指标 | ROC曲线下面积（AUC值）及其95%置信区间（CI） |
效能分析 | 预测模型与Mayo模型比较的效能分析取效能（1–β）为0.8，α = 0.05。 |
分析软件 | 所有分析均采用R版本3.3.2（统计计算的R基础）和MedCale统计软件进行。P值<0.05表示有统计学意义。 |
名词解释：
分类器：利用给定的类别（如恶性与良性对照）和已知的训练数据（如，样本甲基化水平）通过学习产生分类规则（如甲基化水平=168作为阈值）和分类器（如逻辑回归方程），然后对未知数据进行分类（或预测）。
迭代：从一个初始估计值出发寻找一系列近似解来解决问题(一般是解方程或者方程组)的过程。
结果与分析
基于3种DNA甲基化生物标志物和1种影像学特征建立了肺结节良恶性鉴别预测模型。所建立的预测模型在恶性结节诊断中的AUC值为0.951，显著高于三种DNA甲基化生物标志物（0.912，95%CI:0.843-0.958，p=0.013）和梅奥临床模型（0.823，95%CI:0.739-0.890，p=0.001）。用100名结节受试者的测试队列验证了预测模型的诊断价值。
图1.训练队列中，良性与恶性结节的甲基化值（2-⊿Ct）比较（3个靶标基因）
图2、三种预测模型诊断恶性结节的准确性分析（ROC分析）：表明甲基化+影像学预测效果最佳。
表3四种模型之间的准确性和预测值比较
图3、一个独立队列中，良性与恶性结节甲基化水平比较
图4、在独立队列中，利用预测模型得出的ROC分析曲线比较（3个甲基化标记物模型，梅奥模型，甲基化+影像学模型）
结论：本研究建立了一个简单的基于DNA甲基化生物标志物的预测模型，该生物标志物具有影像学特征，可用于鉴别LDCT检出的良性结节和恶性结节。未来使用预测模型可以降低成本，避免良性结节患者的过度侵入性诊疗，同时使得肺癌患者得到及时治疗。该预测模型可与离散余弦变换相结合，提高肺癌的综合诊断水平。
文献来源
Wenqun Xing , Haibo Sun , Chi Yan, Chengzhi Zhao, Dongqing Wang, Mingming Li , Jie Ma，A prediction model based on DNA methylation biomarkers and radiological characteristics for identifying malignant from benign pulmonary nodules，BMC Cancer. 2021 Mar 10;21(1):263. doi: 10.1186/s12885-021-08002-4.
https://blog.sciencenet.cn/blog-3419762-1282883.html
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