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论文赏析：结直肠癌甲基化标志物SDC2的全基因组鉴定与评价
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评述：当前，肿瘤甲基化检测产品研发潮头高企。在肠癌检测领域，SDC2基因甲基化检测技术引起了人们广泛关注。首先是韩国团队2014年4月以SDC2基因为靶标，率先在韩国FDA注册了第一款甲基化检测肠癌的产品EarlyTect™-Colon，随后我国康立明公司2018年在中国FDA注册了同类产品长安心，接下来，艾德公司在2021年也注册了SDC2靶标的同类产品畅青松，还有华大基因公司华常康也是以SDC2为靶标。除此之外，还有多款SDC2和其他基因联合检测肠癌的产品问世。SDC2基因成为了肠癌甲基化检测领域关注的焦点。下面这篇论文首次报道了SDC2基因标记物的发现过程及其临床评价结果, 是一篇引领行业发展的论文, 值得关注。 |
论文赏析：结直肠癌甲基化标志物SDC2的全基因组鉴定与评价
摘要：本研究的目的是寻找结直肠癌标志物并对其进行临床评价。本研究利用甲基化芯片对全基因组甲基化水平进行扫描，通过比较肠癌组织与癌旁组织的甲基化水平和聚焦甲基化差异位点后，最后发现SDC2可较好区分结直肠癌和正常组织。临床试验结果显示，以SDC2甲基化为靶标，血清DNA检测结直肠癌的敏感性为87.0%，特异性为95.2%。
本研究技术路线图
SDC2标记物是如何发现的——甲基化芯片法 1、发现过程：通过肠癌组织与正常组织的比较，找到它们甲基化水平差异显著的基因组区域，进一步聚焦后到6个候选标记物，最后选出SDC2。 2、方法原理：用芯片检测全基因组不同区域的甲基化水平（β值）。对于特定位点而言，M=甲基化探针强度值;U=非甲基化探针强度值，β值=M/(U+M+100)。 3、候选标记物的筛选原则 1) 正常组织的β值尽量低（本底值低避免干扰） 2) 肿瘤组织⊿β值尽量高（肿瘤组织与正常组织差异大） 3) 前后探针跨度大于200bp（便于引物设计） 4) AUC值尽量较大 |
一、材料和方法
（一）样本及其设计
本研究采用了三类样本（细胞系，组织样本和血液样本）开展试验。先用组织样本筛选候选标记物，找到候选标记物后首先用细胞系验证标记物的特异性，然后再用其他组织样本和血液样本进一步验证，最后筛选出最佳标记物SDC2。
表1.1组织样本
组织样本 | 癌症组织样本 | 癌旁组组样本 | 目的 | 方法 |
微阵列分析 | 12对 | 12对 | 发现5个候选标记物 | 芯片法 |
确认分析 | 32对 | 32对 | 验证标记物，选出SDC2 | 测序法 |
临床验证 | 95对 | 95对 | SDC2临床价值评价 | PCR法 |
合计 | 139对 | 139对 |
表1.2 细胞系样本及其培养基
结直肠癌细胞系 | 正常细胞系 | 培养基 | 添加物 | 用途 |
HCT116 | Caco-2 | RPMI 1640 | 10%胎牛血清, 100单位/mL青霉素和100 mg/mL四环素 | 甲基化测序方法的特异性分析 |
表1.3血清样本及其分类（用于PCR检测方法验证）
癌症分期 | I期 | II期 | III期 | IV期 | 合计 |
收集样本 | 11 | 28 | 36 | 12 | 87 |
购买样本 | 15 | 29 | 44 | ||
正常对照 | 125 | ||||
购买健康对照 | 2 |
（二）核酸提取
表2、血清样本的制备与保存
步骤 | 参数 |
抽血 | 全血 |
培养 | 4°C 30分钟 |
离心 | 600×g 15分钟 |
血清 | 1mL的小份 |
储存 | −80°C |
记录 | 患者特征 |
表3.1 DNA提取试剂盒
样本类型 | 试剂盒 |
组织标本和细胞系 | DNA mini试剂盒 |
血清 | 磁珠法，Dynabeads silane viral NA 试剂盒 |
表3.2血清DNA的提取步骤——磁珠法
序号 | 步骤 | 操作 |
1 | 血清样本 | 800mL，分为两份每份400毫升 |
2 | 裂解细胞 | 加100mL蛋白酶K（20mg/mL） |
加裂解/结合缓冲液600 mL | ||
室温培养5分钟 | ||
3 | 磁珠提取 | |
加入异丙醇300mL | ||
加磁 | 加入磁珠100 mL | |
室温摇动培养10分钟 | ||
脱磁 | 磁铁上2分钟分离磁珠 | |
移除上清液 | ||
添加1号洗涤缓冲液850 mL | ||
分离磁珠 | 洗涤重复两次 | |
磁珠干燥 | 磁珠室温干燥10-15分钟 | |
4 | DNA洗脱 | 加入缓冲液30 mL |
孵育70℃3分钟 | ||
洗脱DNA | ||
5 | DNA储存 | -200C直到使用 |
（三）甲基化检测
本研究采取了3种甲基化检测方法：芯片法、测序法和PCR检测法，分别用于候选标记物筛选，标记物验证和标记物的临床评价。
有关甲基化检测技术的内容可以参考https://mp.weixin.qq.com/s/kDCtoiVqgnhgo_o_sdMrgQ?
3.1芯片法
芯片法甲基化检测的目的是：（1）了解全基因组范围甲基化分布及其水平；（2）找出肿瘤与非肿瘤甲基化差异显著的基因组位点（DMR）。
本研究对12对肿瘤及其癌旁组织进行比较研究，发现了32个高甲基化基因和41个低甲基化基因，从中筛选出6个标记物候选基因。
本研究采取甲基化DNA免疫共沉淀技术(MeDIP)与甲基化芯片相结合来聚焦基因组中的甲基化区域。MeDIP是一种采用抗体或甲基化DNA结合蛋白MBD2bt来捕获富集甲基化DNA的技术，这种技术可以发现基因组中高度甲基化的区域，如CpG岛，但不能进行单个碱基水平的分析。
表4、甲基化靶向富集的芯片检测技术要点
序号 | 步骤 | 要点 |
1 | 12对组织样本 | 来自肿瘤和癌旁健康组织 |
2 | DNA | 试剂盒 |
3 | DNA破碎处理 | 超声处理 |
4 | 富集甲基化DNA | 用MBD2bt重组蛋白 |
5 | DNA扩增 | 全基因组扩增试剂盒，Cy5染料标记 |
6 | 纯化被标记的DNA样本 | PCR产物纯化试剂盒 |
7 | 芯片杂交 | 人CpG芯片(237,000探针和27,800注释CpG岛) |
8 | 收集信号 | 获得不同基因的β值 |
9 | 参照基因组 | 12例癌旁组织样本混合DNA（未经甲基化富集和Cy5染料标记） |
10 | 数据处理 | 肿瘤与癌旁组织差异分析 |
成组比较：方差分析+多重比较Benjaminie Hochberg (P < 0.01) | ||
11 | 候选靶基因 | CHST11,KCNA1, IRX5, SIM1, SDC2和SORCS3 |
12 | DMR筛选标准 | 基因内有2个以上探针； CpG岛内最多缺一个探针；肿瘤与非肿瘤甲基化水平不同（一方为甲基化阳性另一方阴性）；以前无报道。 |
3.2 亚硫酸氢盐焦磷酸测序法
为了对以上6个候选靶基因的甲基化水平进行检测和确认，以便从中选出最佳标记物，而采用此方法。
亚硫酸氢盐测序检测细胞或组织中全部染色体DNA上甲基化情况的技术。基于亚硫酸氢盐能使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，然后对PCR产物进行高通量测序。
焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。原理是: 引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。
表5、焦磷酸测序法
序号 | 步骤 | 要点 | ||
1 | 基因组DNA | 细胞系和32对组织样本 | ||
2 | 亚硫酸氢钠转化 | EZ DNA甲基化试剂盒 | ||
DNA在65℃用亚硫酸氢钠处理2.5小时 | ||||
脱硫 | 室温下20分钟 | |||
3 | 纯化 | Zymo-Spin-IC纯化柱 | ||
4 | 洗脱 | 10μL蒸馏水 | ||
储存 | −20°C | |||
5 | PCR扩增 | 体积25mL | 20 ng模板DNA+Taq酶+引物、探针 | |
扩增区 | 2-5个 CpG位点 | |||
6 | 测序 | PyroMark Q96 ID仪器 | ||
PyroGold测序试剂盒 | ||||
7 | 结果分析 | 计算CpG位点甲基化指数（MtI）以及位点内CpG位点甲基化平均值 | ||
8 | 内部质控 | CpG非甲基化胞嘧啶。 | ||
9 | 阳性标准 | 原发肿瘤的MtI值MtI>35%，癌旁组织的MtI值 < 5.0% | ||
3.3甲基化特异性PCR法（qMSP）
建立该方法是为了用血清DNA检测结直肠癌。
序号 | 参数 | 要点 | |
1 | 试剂 | Rotor-Gene probe PCR 试剂盒 | |
2 | 模板DNA | 0.8 ml血清提取DNA，经亚硫酸盐转化处理后作为模板 | |
3 | 靶标 | SDC2甲基化位点 | |
4 | 内标 | ACTB（扩增区不含甲基化位点） | |
5 | SDC2引物 | 5-tagaattataggaggggt-3，5-gactcaaactcgaaactcgaa-3 | |
ACTB引物 | 5-tgtgagagggtttagtaagt-3，5-aaccataacctcctcttaa-3 | ||
6 | SDC2探针 | 5-FAM agtagagagga Iowa Black-3 | |
ACTB探针 | 5-TET-accaacaaca-Iowa Black-3 | ||
7 | 反应体系 | 模板DNA、引物、探针、Taq酶等，反应总体积20μL。 | |
8 | 温度设置 | 略 | |
9
| PCR质量控制 | 内控基因 | ACTB |
转化后阴性对照 | 转化处理后的HCT116基因组DNA | ||
转化后阳性对照 | 转化处理的Caco-2基因组DNA | ||
完全阴性对照 | 无甲基化且未经转化处理的胚胎DNA | ||
完全阳性对照 | 用甲基化酶充分甲基化处理过的HCT116基因组DNA | ||
空白对照 | 无模板对照 | ||
重复1次 | |||
10 | 结果分析 | 甲基化水平PMR= 2⊿⊿Ct ，其中⊿⊿Ct = [(CT(SDC2)- CT(ACTB))sample] - [(CT(SDC2)-CT(ACTB))HCT116] | |
11 | 阳性判断值的确定 | ROC曲线分析当约登指数最大时对应的甲基化水平（CRC vs 健康对照）。 | |
12 | PCR分析性能 | 特异性 | 肿瘤出现阳性信号，非肿瘤阴性 |
最低检测限LOD | 对0.0156 ng -200 ng浓度梯度模板进行分析，每种浓度重复3次 | ||
（四）统计分析
方法 | 目的 | 作用 |
MedCalc软件版本9.3.2.0 | 统计分析 | 医学统计 |
卡方Χ2测试 | 不同分期癌症样本的甲基化阳性率比较 | 用于率或构成比比较以及分类资料的相关分析等。 |
ROC曲线分析 | 获取AUC值、敏感性和特异性 | 1、分析任意截断值对疾病的识别能力。2.选择最佳的截断值。3.对两种及以上不同诊断试验对疾病识别能力进行比较。 |
Kruskal-Wallis试验 | 用于甲基化水平比较和临床病理特征比较 | 属于非参数统计方法，当进行多个群组之间比较时，因群组不满足正态分布而不能使用ANOVA比较时使用。 |
二、结果与分析
1、标记物的筛选
12对组织样本用芯片获得199416个探针的甲基化信号，去除弱信号探针后，剩下43097个探针。方差分析比较肿瘤与非肿瘤甲基化强度，选出差异显著的探针，发现了32个高甲基化和41个低甲基化基因。6个基因在原位癌中表现为高甲基化而且未见过报道，被选为候选靶基因。
图1
候选基因的筛选过程。首先通过MeDIA技术分别从12个原发性恶性肿瘤（T）和配对的癌旁组织（NT）中富集甲基化DNA。分别将甲基化DNA（Cy5）与扩增的普通参考DNA（Cy3）进行比较。选取43097个可靠探针，并根据Pearson相关系数矩阵进行无监督聚类分析。热图表明，有32个高甲基化和41个低甲基化基因的甲基化水平具有统计学意义，其中有6个基因前人没有报道过，被选为候选基因。
2、候选标记物的验证——测序法
标记物发现后首先用肿瘤和非肿瘤细胞系进行测试，再用异质性更高的肿瘤组织和健康组织测试。结果显示，候选基因中SDC2的肿瘤与非肿瘤差异最为显著。SDC2的三个区域又以R3更显著。
图2
6个候选基因的甲基化水平比较（测序法）
A：健康细胞系Caco-2和肿瘤细胞系HCT116的比较
B： 一位83岁女性和一位24岁男性正常健康组织比较
C：原发性肿瘤（T）和癌旁组织（NT）比较
甲基化水平MtI值来自测序法。同一个人的样本用一条直线连接，成对t检验的显著水平*p= 0.001，†P<0.0001。
图3 SDC2基因不同位点（R1,R2,R3）的甲基化水平：肿瘤与癌旁组织成对比较
A：SDC2基因CpG岛及其3个检测靶点（测序法）：R1在启动子区，R2和R3在5’UTR区。图中的TSS表示转录起始位点、5’UTR表示5‘端非编码区，CDS表示编码序列，3条水平线表示PCR的3个靶向扩增区。
B：32对肿瘤（T）和癌旁组织（NT）的甲基化水平MtI比较，同一患者的样本用一条直线连接。配对t检验显著水平*P<0.0001。
表3、SDC2三个靶点的甲基化状态比较（来自32个癌症患者的肿瘤与癌旁组织）
*检测结果是2~4个CpG位点的平均甲基化水平MtI，表示为平均值±标准差。
甲基化阳性定义为MtI肿瘤>MtI正常，其中肿瘤为原发肿瘤，正常为成对的癌旁组织。R3的甲基化水平显著高于R1和R2（P<0.0001）。
图4 SDC2基因的甲基化状态对不同时期肿瘤的检测效果评估（测序法）
原发性肿瘤组织（T）和癌旁组织（NT）的甲基化水平MtI值比较；来自同一患者的样本用一条直线连接，配对t检验的显著水平*P<0.0001，。
3、血清样本SDC2甲基化特异性PCR检测
样本来自CRC肿瘤患者（n = 131）和正常人对照（n = 125）。引物设计在SDC2基因的+378~+498 bp区域，扩增长度覆盖CpG靶标121 bp区段。结果显示，肿瘤所有时期的甲基化水平都显著高于对照。
图5 血清DNA检测SDC2甲基化的结果：A、肿瘤不同时期与对照的甲基化水平比较；B、ROC曲线分析结果
PMR截断值设定为0.936，总敏感性和特异性分别为87.0% (114/131; 95% CI, 80.0%- 92.3%) 和 95.2% (6/125; 95% CI, 89.8% - 98.2%)， AUC=0.927 (95% CI, 0.887 to 0.955;P=0.0001).
结直肠癌I期敏感性92% (24/26), II期 82% (47/57), III期 89%(32/36)和IV期92% (11/12)。分期之间敏感性无显著差异。
原文请参考:
Genome-Wide Identification and Validation of a Novel Methylation Biomarker, SDC2, for Blood-Based Detection of Colorectal Cancer,TaeJeong Oh et al.,J Mol Diagn 2013, 15: 498e507; http://dx.doi.org/10.1016/j.jmoldx.2013.03.004
https://blog.sciencenet.cn/blog-3419762-1284526.html
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