论文赏析:

早期肝癌的血液检测：甲基化与蛋白标志物联检法（HepaClear）

本研究的目的是通过血液样本的甲基化qMSP和蛋白标志物联检早期发现肝细胞癌。研究包括四大部分内容：

研究流程图

结果

最佳标记物组合HepaClear ：包含 3 个高甲基化 CpG 位点（cg14263942、cg12701184 和 cg14570307）和 2 个蛋白质标记物（AFP 和 DCP）。

150个血液样本的标记物评分由以下逻辑回归方程得出：Score = 30.9062 − 0.3385 × cg14263942 − 0.2114 × cg12701184 − 0.2202 × cg14570307 + 0.3362 × log2AFP + 0.2656 × log2DCP. 

cg14263942、cg12701184和cg14570307是3个甲基化位点的甲基化水平变量（ΔCt）；AFP和DCP是蛋白标记的表达水平变量

将样本的标记物得分(Score) 与临床病理检查的金标准结果相结合进行ROC曲线分析，得到以下结果:

HepaClear-PCR检测体系的测试结果如下：

图表欣赏

图1A、火山图：本研究采取850k芯片在60对组织样本中探测到不同CpG位点及其甲基化水平数据，按照肝癌与对照的甲基化水平差异情况绘制出火山图。火山图的横坐标是∆β值，即肝癌与非肝癌组织样本的甲基化水平之差值；纵坐标是∆β值t测验得到的显著性概率p值的对数（该值越大表示肝癌与对照的甲基化水平差异越显著）。图中的n代表CpG位点数，图中的每一个坐标点代表一个CpG位点。绿色部分是肿瘤与非肿瘤的∆β值小于0.1的CpG位点，蓝色部分是肿瘤低甲基化的CpG位点（n=216246），红色是高甲基化位点（n=31837个）(可见低甲基化位点在数量上大大多于高甲基化位点）。理想的CpG位点是分布在右上方的红色CpG位点，表现为肝癌与非肝癌甲基化水平差异大，而且p值对数高。

图1B、尽管差异CpG位点有很多，很多位点具有相关性，它们可以通过主成分分析简化为几个不相关的主成分。头两个主成分对总变异的贡献率分别为88.5%和4.2%，累计贡献率达到92.7%，可以将60对肿瘤样本与对照样本较好地分开。

图1C、该热图中的颜色与甲基化β值相对应。行代表不同的 CpG 位点，列代表不同的组织样本。热图来自前 1000 个甲基化 CpG 位点的无监督层次聚类分析。 

*火山图、主成分分析图、热图的制作见https://ibook.antpedia.com/x/864460.html

图2A、60 对组织样本（HCC 和正常对照）的qMSP测试结果：10 个候选CpG 位点的甲基化水平（ΔCt = Ctreference - Cttarget）。y轴代表甲基化水平（ΔCt），ΔCt越小代表甲基化水平越高。****表示p < 0.0001。

图2B、150个血浆样本的qMSP测试结果：获得8个CpG标志物的甲基化水平，分别进行单个CpG标志物的ROC分析得到各自的曲线下面积 (AUC)。AUC > 0.8 和 < 0.8 的标记物分别以红色和蓝色表示。

图2C、基于150个血浆样本qMSP结果的建模研究：4个不同标志物组合的ROC分析。

 4个不同组合如下：

3 个甲基化 CpG 位点（cg14263942、cg12701184 和 cg14570307）

6 个甲基化 CpG 位点（cg14263942、cg12701184、cg14570307、cg15457058、cg07689503、cg20172627)、

3 个甲基化 CpG 位点+（AFP 和 DCP）

6甲基化 CpG 位点+ （AFP 和 DCP） 

括号中的数字是AUC值。

表1 ROC分析结果：10个高甲基化CpG位点的qMSP检测性能评估（基于150个血液样本）

图 3 HepaClear面板 在训练集和验证集中的性能表现：ROC分析

图3A和B: HepaClear面板在训练组中的表现：所有肝癌分期的患者 (A) 和早期患者(B)比较；HepaClear 面板与单独使用蛋白标志物AFP 和 DCP 的性能比较。可以看出HepaClear面板的预测效果优于蛋白标志物AFP 和 DCP。对晚期的预测效果尤佳。

图3 C和D ：不同病程（健康对照、CHB、LC 和 HCC） 患者的HepaClear 面板综合得分分布图。可以看出，HepaClear 面板在健康组中综合得分最低，病期越晚得分越高，肝癌患者评分最高。训练集与验证集结果一致。