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DNA甲基化技术及其优劣势比较

已有 978 次阅读 2023-11-14 09:42 |系统分类:科研笔记

全基因组甲基化研究策略

一、甲基化芯片

以Illumina的450K芯片为例,该芯片采用两种分析:Infinium I和Infinium Ⅱ,前者有两种bead(微珠),分别是甲基化M和非甲基化U,后者则是一种bead(不区分甲基化和非甲基化)。

如图A:Infinium I,在未甲基化的GpC locus,U型bead尾部为A,与未甲基化CpG位点相匹配,能够成功进行单核苷酸延伸并被检测到(U型磁珠发光),而M型bead尾部为G,与未甲基化位点不能匹配,没有信号产生;在甲基化的GpC locus,M型bead能与甲基化CpG位点相匹配,单核苷酸延伸并产生信号(M型磁珠发光),而U型bead则不匹配,不产生信号

如图B:Infinium Ⅱ探针则不区分M和U,探针尾部为C,配对后只加入单个碱基(ddNTP-BioT, ddNTP-DNP),然后根据荧光颜色判断加入碱基的类型,进而确定该位点是否被甲基化

探针长度为50bp,基于假设在50bp内的CpG位点具有相同的甲基化状态,具有区域相关性

通过计算甲基化和非甲基化位点的荧光信号比例,可确定某位点的甲基化水平(Beta值=M/(M+UM)

二、WGBS

三、简化亚硫酸氢盐测序技术(RRBS)

RRBS(Reduced representation bisulfite sequencing) ,即简并代表性亚硫酸氢盐测序技术。是一种用于基因组单核苷酸级别的甲基化水平分析的高效的高通量测序技术。这项技术结合了限制性内切酶和亚硫酸氢盐测序,从而得到高CpG区域的富集信息。相比较全基因组甲基化测序技术,RRBS仅需要对基因组约1%的区域进行测序,因此费用大大降低。

技术流程

1. 酶切;2.末端补齐;3.测序文库制备;4.纯化;5.亚硫酸氢盐转化;6.PCR扩增;7.PCR纯化;8.测序;9.测序数据比对与分析

甲基化芯片

优点:在全基因组尺度检测,信息量大;在人中有效检测和生物学时间相关区域的甲基化;

缺点:芯片杂交要求的设备昂贵;芯片限于人的样本;只能覆盖有限的CpG位点。

WGBS

优点:通量高 ,全基因组范围;单碱基分辨率;

缺点:成本高,不适于大样本研究分析;不适于特异位点、基因或区段研究。

RRBS

优点:在全基因组尺度检测;分辨率达到CpG水平;不依赖限制性位点;样本被精简过,导致测序成本低;

缺点:虽然降低了成本,但价格仍然较高;对甲基化CpG覆盖程度有限;目的不够明确;基因组覆盖不全容易遗漏一些关键的区间。

特异位点甲基化研究策略

一、甲基化敏感性限制性内切酶

优点:相对简单,成本低廉,甲基化位点明确,实验结果易解释;

缺点:

1.由于CG不仅仅限于CCGG序列中,因此非该序列中的CG将被忽略;

2.只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时,该检测方法的结果才有意义;

3.相对而言,Southern方法较复杂,且需要样本的量大;

4.存在着酶不完全消化引起的假阳性的问题;

5.不适用于混合样本;

6.杂交需要放射性标记;

7.覆盖有限的CpG位点。

二、Bisulfite sequencing PCR (BSP)

基因组DNA经亚硫酸氢盐处理后,设计BSP引物扩增目的片段,最后对PCR产物进行克隆并选取8-10个转化子序列,即可确定所研究的CpG区域的甲基化频率。

优点:可定性和定量检测CpG位点甲基化状态;片段有效长度较长;

缺点:通量低;成本高(测序成本和未转化对照);实验周期较长;直接测序信号质量差,克隆测序操作繁琐,不宜大批量操作。

三、Methylation specific PCR (MSP)

首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA,然后针对甲基化和非甲基化引物进行PCR扩增,确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。

优点:灵敏度高,操作方便,经济适用,节约时间;

缺点:只能定性,不可定量(半定量),特异性低;需要参考序列,引物设计非常重要;若待测DNA中5mC分布极不均衡,检测结果较为复杂。

四、焦磷酸测序

五、飞行质谱法

优点:不依赖于限制性位点;分析片段比焦磷酸测序长200-600bp;检测模板量低至20ng;可确定单一位点甲基化程度;灵敏度可低至5%;

缺点:引物设计有时候较难;硬件昂贵;实验复杂、耗时,人为干预程度高,如PCR反应均应设空白对照和已知阳性对照,PCR产物转移至质谱仪进行甲基化检测时设置完全非甲基化样本和完全甲基化样本进行对照,需要操作规范,防止加样交叉污染等才能确保结果真实性;经过2次处理,1次酶切,如处理和酶切不完全,则结果受影响较大。

六、MeDIP-chip/seq

MeDIP-chip

优点:在全基因组尺度检测;不依赖限制性位点

缺点:抗体和微阵列需求的仪器昂贵;分辨率

MeDIP-seq

优点:在全基因组尺度检测;分辨率达到CpG水平;不依赖限制性位点,覆盖范围广;样本被富集过,导致测序成本低;

缺点:抗体特异性要求高;测序成本高;对于区分甲基化区域来说,和同等方法相比不够强大

靶向甲基化重测序

翼和策略:目标区间甲基化重测序(Hi-MethylSeq)

技术路线:

优势:Hi-Methylseq结合了亚硫酸盐转换、靶向扩增子高通量测序技术,可实现多区段、多位点的甲基化精确定量分析。

应用:1、 适用于感兴趣的目的片段的甲基化研究 ;

2、适用于在大样本中进一步确认全基因组甲基化研究挑选的阳性位点。

文献:1、 Masser et al. Epigenetics & Chromatin 2013, 6:33

2、Ashktorab et al. Epigenetics 2014, 9(4): 503-512

3、Beth et al. J CHILD PSYCHOL PSYC 2016,2(57):152-160




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