外源微生物污染的检测一直被高度关注，早在2003年3月国家药品监督管理局就在颁布的《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》与《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》（国家药品监督管理局，2003）中，规定细胞与基因治疗（cell and gene therapy, CGT）相关产品必须进行无菌检查（时称无菌试验）。2017年12月颁布的《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》（国家食品药品监管总局，2017），也将无菌检查列为质量控制的一般检查项目。及至2022年5月颁布的《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》与《免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》（国家药品监督管理局，2022），无菌检查为外源因子必检项目首位，具体方法可参考《中国药典》。上述两个指导原则亦指出，在需要快速放行等特殊情况下，如药典方法无法满足，可考虑开发新型的无菌和支原体检测方法进行放行检测，但是新型检测方法应经过充分验证。2024年1月颁布的《重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则》（国家药品监督管理局，2024）中，对无菌检查又提出了新要求，即除参考《中国药典》外，首次提出也需要参考ICH Q5A《来源于人或动物细胞系的生物技术产品的病毒安全性评价》（ICH，2023）中的相关内容。上述文件初步形成了临床试验环节的技术标准和指南体系，在法律位阶上属于部门规章或规范范畴，因此CGT相关企业应当遵照执行。

事实上，欧洲药典与美国药典，也有类似的规定。如美国药典42版国家处方集37版通则《短效期产品放行的快速微生物检查：依据风险评估的方法》、《欧洲药典》( 9. 2) 2. 6. 27. “细胞制品的微生物检查”，这些文件均对基因治疗与免疫治疗产品的外源微生物检测提供了详细的指导。

快速微生物检测方法（rapid microbiological method, RMM），依据中国药典的分类标准，主要基于三种原理：1）微生物培养，即分析生长过程中的化学成分、电荷、气体、能量，如依赖于ATP或ATP合成酶得到的荧光，又如二氧化碳检测；2）活细胞识别，如利用荧光标记细胞进行计数的流式细胞术或固相细胞计数；3）微生物生物组成成分的检测，如基于核酸、蛋白、脂肪酸来检测。

 RMM原理

就具体检测方法而言，在2020版《中国药典》四部通则1101<无菌检查法>中，明确提出采用培养法时，所使用的的质控阳性菌为金黄色葡萄求菌(Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、白色念珠菌(Candida albicans）与黑曲霉(Aspergillus niger)等六个菌株。而通则9201<药品微生物检验替代方法验证指导原则>明确指出，核酸扩增法可以用于药品微生物检验。 

质控阳性菌

检测限不低于100CFU。

用于确定生物制品中细菌真菌的DNA含量的分析程序可以是定量PCR（q-PCR）或其他DNA扩增方法。

qPCR的检测通常是普适性技术，因为它们可以轻易满足灵敏度、人员培训、仪器设备的要求。

基于TaqMan探针荧光定量PCR原理的检测方案：选择细菌（金黄色葡萄求菌、生孢梭菌、枯草牙孢杆菌、铜绿假胞杆菌）和真菌（白色念珠菌和黑曲霉）基因中特异基因片段，分别设计引物和荧光探针，快速检测4种细菌和2种真菌的基因组DNA。

结合相关的样本前处理和DNA抽提方案，本试剂盒可以检测各类生物制品和细胞培养物中潜在的金黄色葡萄求菌、生孢梭菌、枯草牙孢杆菌、铜绿假胞杆菌、白色念珠菌和黑曲霉污染。

原理图

优势特点

灵敏：配合推荐使用的核酸抽提方案，检测灵敏度达到10CFU/mL。

可靠：抽提加入内标核酸，全过程质量控制。

稳定：全程闭管操作，无交叉污染。

快捷：单管可同时检测6种菌种，检测效率高。

准确：样本设置3重复，避免假阴、阳性的出现。

R试剂盒R