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瑞典纪事: 实验记录DNA提取/PCR/毛细管电泳
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以下是在瑞典的实验记录, 之前, 操作都是靠口授心传, 加上自己操作. 我将这些步骤详细记录下来.
共分为: DNA提取(离心柱法), 浓度测定, DNA提取的电泳检验, PCR, PCR产物的凝胶电泳检验,毛细管电泳, 96孔板进行DNA提取以及检验等.
全部内容, 均根据自己所做实验整理而成.
实验一 用试剂盒提取植物的全DNA
目的： 从针叶或种子提取裸子植物全DNA，用于SSR，Barcoding等进一步分析。
准备：
1. 取冰。冰在UPSC 二楼049房间。
2. 将Elution buffer 在65℃烘箱中预热。
操作步骤：
1. 每个待提取DNA样品取2枚针叶，在实验记录本上按照统一编号记录，并誊写样品标签上的所有信息。将2 mL圆底离心管按顺序编号，放在32孔板上。取约60mg针叶（Pinus sylvestris两针），剪碎（长宽不超过3mm），放入圆底离心管中。
2. 加入600μL SP1溶液，加入1μL RNase（在4℃冰箱中） 和 2粒瓷珠。
3. 在mixer mill上充分破碎，一般2min即可，若未打碎，继续破碎2min。
4. 将圆底离心管放在65℃ 金属浴，10min － 15min ，中间混合1－2次。
5. 加入210μL SP2，放冰上5min。
6. 14000rpm离心，5min。
*7. 取上清液到绿柱子，12000rpm，1min （对于种子，步骤可以省略）
8. 将上清液移到2mL新的圆底离心管，加入1.5倍体积的SP3（一般为500 － 700μL），混合均匀。
9. 将700μL上清液转移到蓝柱子（放在新的无盖离心管中，注意柱子和离心管都要标号）， 12000rpm， 1min，倒掉离心管下的液体。
10. 将第8步剩余的上清液继续转移到蓝柱子，12000rpm，1min，倒掉离心管下的液体。
11. 加入500μL的Washing Buffer到蓝柱子，12000rpm，1min，倒掉离心管下的液体。
12. 重复第11步。
13. 将蓝柱子放回原离心管离心，14000rpm，2min。
14. 取干净的EP管，标号。将蓝柱子放入干净的EP 管中，加入90μL 65℃ Elution Buffer洗脱，等候约4min， 12000rpm， 离心1min。
15. 丢弃蓝柱子，将EP管（下面的溶液即为提好的DNA）贴好标签，写上实验纪录上的编号，放入4℃冰箱保存。
如果为种子：
发芽至外露1－2cm，除去种皮， 整粒种子放入2mL圆底离心管。以下程序同。 最后洗脱用100μL Elution Buffer。若需要洗脱完全，则考虑用50μL进行第二次洗脱。
实验二 DNA样品的琼脂糖凝胶电泳检测
目的： 用琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取是否成功
准备：烘箱65℃，打开
操作步骤：
1 在电子天平上称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶。
2 用量筒量取120mLTBE溶液，倒入锥形瓶。
3 将锥形瓶在微波炉中加热三分钟，在沸腾后，轻摇几次，使得琼脂糖全部溶化。
4 放在常温冷却，待65℃左右，（至外边仍然比较烫手，但没有蒸气散出时）。加入8μL EB（溴化乙锭），摇匀。
5 将胶槽两端用不干胶封好，倒入30mL左右的溶液，插入胶孔成型用的梳子，待15到20分钟冷凝。将锥形瓶用多层保鲜膜盖好，并用铝箔封口，放在65℃的烘箱中。
6点 Loading Buffer。每一次取10μL的红色Loading Buffer，分成五份，每个约两μL，点在事先固定在tip盒盖的石蜡膜上。按照样品的数量，点出相应数量的Loading Buffer水珠。
7 点Lambda标准样（试剂公司合成的特定浓度的DNA样品），2μL，若是两排胶孔，应该点两个Lambda标准样。
8 吸取DNA样品，每个吸取2μL，为防止DNA样品的污染，每一次都要换枪头。按照次序点入Loading Buffer水珠中。
9 将胶放置在电泳槽中，令电泳液将其浸入。注意，胶孔一端要放在负极（黑色电极）一端。
10 点样，先在最左侧的胶孔中点入lambda样，将移液器的量程调至4－5μL，按照顺序，吸取水珠，点入胶孔中，此时不必每一次都换枪头。
11 将电泳仪电压调到80－110V之间，电泳15分钟。
12 取胶：先关闭电源，戴上蓝色在Techtum Lab AB凝胶成像系统中拍照。拍照时用MVPILOT软件，点击摄像机的图标，调整对比度和明暗效果，在左侧MITSUBISHI打印机上打印。保存图像时，点击照相机的图标。
13 完成拍照后，将凝胶丢弃，仪器擦拭干净，并保持Techtum Lab AB的门打开。
实验三 用Nanodrop检测DNA浓度
目的： Nanodrop分光光度计测量提取的DNA浓度
操作步骤：
1. 双击打开Nanodrop管理界面，点击Nucleic Acid Measurement。将Nanodrop的探测器旋臂抬起，用蒸馏水擦拭干净。
2. 用移液器吸取1μL 双蒸水（量程可调至1.2μL），点在探头上，盖好，点击Initialize按钮。
3. 打开探测器旋臂，用移液器点一滴Elution Buffer（这是由于之前用的是Elution Buffer，待测的DNA溶于什么溶液，就应该用相应的溶液作为本底对照），点击Blank按钮
4. 抬起旋臂，擦拭干净，换枪头，吸取1.2μL的待测样品，点Measure按钮，记录右下角的DNA浓度。
5． 依次重复步骤4，直至所有样品的浓度都测定完。
实验四 PCR 反应
步骤：
（1） 将引物成对摆放，9对引物一定要两两放在一起，并排号。在冰板上，放置9个 ep排管，用以9个不同的引物体系。因每排管由8个小ep管组成，每个96孔板上只能做8个DNA样品（8 *9 ＝ 72组合）。
（2） 将待检测模板DNA用ddH2O稀释到10ng /uL ，贴上标签，放在4℃保存。
（3） 按照DNA样品的数量，计算每对引物各组分的体积。每个组分扩大的倍数，取决于模板DNA的数目（实际情况下的体系的体积倍数要比DNA的数量稍多，每个1.5mL 的ep管内各组分需要到达足够的体积，才能准确量取以及混合）。
（4）取9个1.5mL的ep管，分别按照顺序，添加表1中除DNA模板外的组分。
表1 16uL PCR反应体系
order Constituents Storage Volume Per PCR Tube ×
1 ddH2O RT 11.85uL uL
2 PCR buffer 10× 4℃ 1.6uL uL
3 dNTP (25mM/uL) 4℃ 0.1uL (0.156mM) uL
4 Ordinary Primer (10uM) 4℃ 0.2uL (0.125uM) uL
5 With Dye Primer (10uM) 4℃ 0.2uL (0.125uM) uL
6 TopTaq (5 Unit/uL) －20℃ 0.05uL (0.25unit) uL
分装到各ep管，每管14uL
7 DNA template 2uL (10-20ng) 每个样品吸取2uL 模板DNA
Total 16uL
（5） 将混合好的体系，按照行，分装到同一排管的小ep管中，每个14uL。
（6） 从稀释过的DNA（约10ng/uL），吸取2uL，按照列，添加到排管的小ep管中。
（7） 手动混合反应体系，离心。 按照所需退火温度不同，分成三组：
第一组 LOP1和SsrPt_ctg4363，touch down 温度为 64 – 54℃
第二组 PtTx3107和PtTX4001，touch down 温度为55－45℃
第三组PtTX2146，PtTX3025，PtTX3116，SsrPt_ctg1376, SPAC12.5，touch down为60－50℃。 ?（8）每个PCR反应耗时约2－2.5h。注意，PCR仪在最后的延伸完成后，会降到15℃，应该尽快将产物转移到4℃冰箱中， 并尽快检测。
Table 2. Primers and PCR conditions for each locus (Part I) version 0.3
ID 1 2 3 4 5
Locus LOP1 PtTX2146 PtTX3025 PtTX3107 PtTX3116
Dye Cy5.5 green D2 Black D2 Black D2 Black Cy5 Blue
Forward(5-3) GGCTAATGGCCGGCCAGTGCT CCTGGGGATTTGGATTGGGTATTTG CACGCTGTATAATAACAATCTA AAACAAGCCCACATCGTCAATC CCTCCCAAAGCCTAAAGAAT
Reverse(5-3) GCGATTACAGGGTTGCAGCCT ATATTTTCCTTGCCCCTTCCAGACA TTCTATATTCGCTTTTAGTTTC TCCCCTGGATCTGAGGA CATACAAGGCCTTATCTTACAGAA
Ta Touch down 64-54°C Touch down 60-50°C Touch down 60-50°C Touch down 55-45°C Touch down 60-50°C
size range 153-189 176-264 211-305 150-174 115-169
PCR Conditions
1 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation
18 cycles 2 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s
3 30 S from 64 °C to 54 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 55°C to 45 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle
4 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S
25
cycles 5 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s
6 54 °C 30s 50 °C 30s 50 °C 30s 45 °C 30s 50 °C 30s
7 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s
Final extention 8 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min
Preservation 15°C -- 15°C -- 15°C -- 15°C -- 15°C --
Date: 2012-3-13
Jinlong
Table 2. Primers and PCR conditions for each locus (Part II) version 0.3
ID 6 7 8 9
Locus PtTX4001 SsrPt_ctg1376 SsrPt_ctg4363 SPAC12.5
Dye Cy5 Blue Cy5.5 Green Cy5 Blue Cy5.5 Green
Forward(5-3) CTATTTGAGTTAAGAAGGGAGTC CGATATTATGGATTTTGCTTGTGA TAATAATTCAAGCCACCCCG CTTCTTCACTAGTTTCCTTTGG
Reverse(5-3) CTGTGGGTAGCATCATC AAATGCATGCCAAACTTAAATAC AGCAGGCTAATAACAACACGC TTGGTTATAGGCATAGATTGC
Ta Touch down 55-45°C Touch down 60-50°C Touch down 64-54°C Touch down 60-50°C
size range 198-229 88-124 95-106 118-184
PCR Conditions
1 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation
18 cycles 2 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s
3 30 S from 55°C to 45 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 64 °C to 54 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle
4 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S
25
cycles 5 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s
6 45 °C 30s 50 °C 30s 54 °C 30s 50 °C 30s
7 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s
Final
extention 8 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min
Preservation 15°C -- 15°C -- 15°C -- 15°C --
Date: 2012-3-13
Jinlong
实验五 PCR产物的检测
步骤：
一 治胶
1 在电子天平上称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶。
2 用量筒量取120mLTBE溶液，倒入锥形瓶。
3 将锥形瓶在微波炉中加热三分钟，在沸腾后，轻摇几次，使得琼脂糖全部溶化。
4 放在常温冷却，待65℃左右，（至外边仍然比较烫手，但没有蒸气散出时）。加入0.8μL EB（溴化乙锭），摇匀。
1 － 4 仅适用于首次做胶时参考。
5 将胶槽两端用不干胶封好，倒入30mL左右的溶液，插入胶孔成型用的梳子，待15到20min冷凝。将盛有剩余溶胶的锥形瓶用多层保鲜膜盖好，并用铝箔封口，放在65℃的烘箱中。
二 点样
6点 Loading Buffer。每一次取10μL的红色Loading Buffer，分成五份，每个约2μL，点在事先固定在tip盒盖的石蜡膜上。按照样品的数量，点出相应数量的Loading Buffer水珠。
7 点Ladder DNA标准样，5μL，若是两排胶孔，应该点Ladder DNA标准样。
8 吸取DNA样品，每个吸取4μL，为防止DNA样品的污染，每一次都要换枪头。按照次序点入Loading Buffer的水珠中。
9 将胶放置在电泳槽中，令电泳液将其浸入。注意，胶孔一端要放在负极（黑色电极）一端。
10 点样，先在最左侧的胶孔中点入lambda样，将移液器的量程调至4－5μL，按照顺序，吸取水珠，点入胶孔中，此时不必每一次都换枪头。
三 电泳
11 将电泳仪电压调到80－110V之间，电泳15分钟。
四 紫外光检测
12 取胶：先关闭电源，戴上蓝色在Techtum Lab AB凝胶成像系统中拍照。拍照时用MVPILOT软件，点击摄像机的图标，调整对比度和明暗效果，在左侧MITSUBISHI打印机上打印。保存图像时，点击照相机的图标。
13 完成拍照后，将凝胶丢弃，仪器擦拭干净，并保持Techtum Lab AB的门打开。
实验六 用96孔板提取Scots Pine种子DNA
准备：
SP1 在使用前，每200μL加入1uL的RNAse， 如研磨2×96材料，则取SP1 40mL，加入200uLRNAse。 放在65℃烘箱预热。
Elution Buffer 65℃预热
步骤：
1. 取96孔板，每个孔放1颗瓷珠，1粒Scots Pine种子，盖好。
2. 充分研磨破碎1min，在UPSC 6th floor。3700rpm离心1，使碎片落入管底，继续破碎1min。
3. 开盖加入200μL SP1，放65℃ 烘箱中10min，混匀两次，将壁上的液体离心到底部（2000rpm）
4 .加入70μL SP2，盖好，混匀，短离心，
5 .放入-20℃冰箱 10min
6. 3700rpm 离心10min
7. 将上清液移动到1.2mL管中（约200μL）
8. 加入1.5体积的SP3 （约300μL）
9. 盖好，混匀20s， 短离心（到3000rpm）
10. 将柱子板放方孔底座上，每孔加入150μL Equilibration Buffer， 混匀，静置4min， 3000rpm离心 2min
11. 每个管中取500μL样品移到 HiBind DNA柱子板上，置于方孔底座上。
12. 盖好尼龙膜，3700rpm离心 3min。
13. 去掉尼龙膜，倒掉方孔底座中的液体。
14. 加入800μL SPW Wash Buffer， 盖好尼龙膜， 3700离心3min，倒掉方孔底座中的液体。
15. 加入800μL SPW Wash Buffer， 3700离心5min，倒掉方孔底座中的液体，再离心10min，以彻底去掉乙醇，倒掉方孔底座中的液体。放在通风厨10分钟，晾干。
16. 将柱子板放在1.2mL排管上，用100μL 65℃ 预热的Elution Buffer洗脱。在65℃温箱中静置5min。 3700rpm离心 5min。
17. 1.2mL排管盖好，保存在4℃冰箱中，其余丢弃。
对DNA进行常规琼脂糖凝胶电泳检测， 2uLDNA， lambda标准样 2uL
20120329
实验七96孔板PCR
1 稀释模板DNA
将提取到的总 DNA 吸取到96孔板上，根据Nanodrop对DNA的测量结果，用ddH2O稀释到10-20ng/uL，需要根据PCR的次数和每次DNA样品量确定要吸 取的DNA量，保证取样量至少多15uL以上。作为模板DNA，写清楚模板DNA的序号，日期，标签如下 Plate-I，放在4°C保存。
2 准备模板标签
对于96孔板，每一格填写如下信息： 1 序号（1-96，一般按照列保存） 2 DNA序列号（如E4218） 3 树编号 （UID，即每棵树所取的哪颗种子 如 81-8，表示81号树的第8颗种子）。
3 模板DNA取样
用排枪取2μL的模板DNA，加入到到96孔板管底部。由于不带有荧光，模板DNA的枪头可收集起来，可以作为毛细管电泳时混合样品用的枪头，但是要做好标记。
4 混合反应体系 Master Mix
No. Conponent Volume per tube Concentration ×25 Storage
1 ddH2O 10.95 - 273.75 RT
2 10×PCR buffer 1.6 - 40 -4°C
3 2.5mM dNTP 1 0.15625 25 -4°C
4 Forward Primer 0.2 0.125 5 -4°C
5 Reverse Primer 0.2 0.125 5 -4°C
6 Top Taq 0.05 2.5U 1.25 -20°C
对于任意一板的PCR反应，需要准备4个1.5mL的ep管，先放在冰盒上，按照1-6的顺序添加各组分到ep管中。盖好盖子，短离心，涡旋，短离心，确保体系混合均匀。
5 用电子移液器（该移液器每次可吸取100μL，由于需要加入的反应体系是14μL，因此只能加7次，注意第一次吸取的液体要打掉，长音表明是最后一次），吸取反应体系，每管加入14μL。
6 在96孔板的边缘标记好Plate号，引物名称等，之后贴Bio-Rad的PCR厚膜，用手柄压实，确保每一管的封口都严密。
7 在振荡器上涡旋4-5下，确保反应体系和模板DNA充分混合。短离心，达到2000rpm以上。
8 按照如下条件，设定touch down PCR:
Tab.1 LOP1 TD 64 to 54 Tab. 2 PtTX2146 TD 60 to 50
Tab.3 PtTX3025 TD 55 to 45 Tab. 4 PtTX3107 TD 55 to 45
Tab.5 PtTX3116 TD 60 to 50 Tab. 6 PtTX4001 TD 60 to 50
Tab.7 SsrPt_ctg1376 TD 60 to 50 Tab. 8 SsrPt_ctg4363 TD 64 to 54
Tab.9 SPAC12.5 TD 55 to 45
9 每个PCR需要耗时2.5h左右。反应结束后，将产物放到4°C冰箱中保存。
10. 对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，一般每板随机抽检16个样品，点样的量一般为：
Loading Buffer 2.5 μL
PCR产物 3μL
Ladder DNA 5μL
实验七96孔板PCR
1 稀释模板DNA
将提取到的总 DNA 吸取到96孔板上，根据Nanodrop对DNA的测量结果，用ddH2O稀释到10-20ng/uL，需要根据PCR的次数和每次DNA样品量确定要吸 取的DNA量，保证取样量至少多15uL以上。作为模板DNA，写清楚模板DNA的序号，日期，标签如下 Plate-I，放在4°C保存。
2 准备模板标签
对于96孔板，每一格填写如下信息： 1 序号（1-96，一般按照列保存） 2 DNA序列号（如E4218） 3 树编号 （UID，即每棵树所取的哪颗种子 如 81-8，表示81号树的第8颗种子）。
3 模板DNA取样
用排枪取2μL的模板DNA，加入到到96孔板管底部。由于不带有荧光，模板DNA的枪头可收集起来，可以作为毛细管电泳时混合样品用的枪头，但是要做好标记。
4 混合反应体系 Master Mix
No. Conponent Volume per tube Concentration ×25 Storage
1 ddH2O 10.95 - 273.75 RT
2 10×PCR buffer 1.6 - 40 -4°C
3 2.5mM dNTP 1 0.15625 25 -4°C
4 Forward Primer 0.2 0.125 5 -4°C
5 Reverse Primer 0.2 0.125 5 -4°C
6 Top Taq 0.05 2.5U 1.25 -20°C
对于任意一板的PCR反应，需要准备4个1.5mL的ep管，先放在冰盒上，按照1-6的顺序添加各组分到ep管中。盖好盖子，短离心，涡旋，短离心，确保体系混合均匀。
5 用电子移液器（该移液器每次可吸取100μL，由于需要加入的反应体系是14μL，因此只能加7次，注意第一次吸取的液体要打掉，长音表明是最后一次），吸取反应体系，每管加入14μL。
6 在96孔板的边缘标记好Plate号，引物名称等，之后贴Bio-Rad的PCR厚膜，用手柄压实，确保每一管的封口都严密。
7 在振荡器上涡旋4-5下，确保反应体系和模板DNA充分混合。短离心，达到2000rpm以上。
8 按照如下条件，设定touch down PCR:
Tab.1 LOP1 TD 64 to 54 Tab. 2 PtTX2146 TD 60 to 50
Tab.3 PtTX3025 TD 55 to 45 Tab. 4 PtTX3107 TD 55 to 45
Tab.5 PtTX3116 TD 60 to 50 Tab. 6 PtTX4001 TD 60 to 50
Tab.7 SsrPt_ctg1376 TD 60 to 50 Tab. 8 SsrPt_ctg4363 TD 64 to 54
Tab.9 SPAC12.5 TD 55 to 45
9 每个PCR需要耗时2.5h左右。反应结束后，将产物放到4°C冰箱中保存。
10. 对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，一般每板随机抽检16个样品，点样的量一般为：
Loading Buffer 2.5 μL
PCR产物 3μL
Ladder DNA 5μL
实验八在CEQ 8000上进行毛细管电泳
一 准备Excel 作为样品的Label
每一板混合样的侧面，应该用记号笔标注清楚 ，例如2012-03-29-Plate-I-a
标签 文件，应该保存在Excel中，待毛细管电泳时，直接拷贝到CEQ8000的界面中。
表 2 96孔板标签的排列
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 69-1-a 69-2-a 69-3-a 69-4-a 69-5-a 69-6-a 69-7-a 69-8-a 69-9-a 69-10-a 69-11-a 143-4-a
B 71-1-a 71-2-a 71-3-a 71-4-a 143-1-a 143-2-a 71-7-a 71-8-a 143-3-a 71-10-a 71-11-a 71-12-a
C 73-1-a 73-2-a 73-3-a 73-4-a 73-5-a 73-6-a 73-7-a 73-8-a 73-9-a 73-10-a 73-11-a 73-12-a
D 74-1-a 74-2-a 74-3-a 74-4-a 74-5-a 74-6-a 74-7-a 74-8-a 74-9-a 74-10-a 74-11-a 74-12-a
E 81-1-a 81-2-a 81-3-a 81-4-a 81-5-a 81-6-a 81-7-a 81-8-a 81-9-a 81-10-a 81-11-a 81-12-a
F 82-1-a 82-2-a 82-3-a 82-4-a 82-5-a 82-6-a 82-7-a 82-8-a 82-9-a 82-10-a 82-11-a 82-12-a
G 84-1-a 84-2-a 84-3-a 84-4-a 84-5-a 84-6-a 84-7-a 84-8-a 84-9-a 84-10-a 84-11-a 84-12-a
H 86-1-a 86-2-a 86-3-a 86-4-a 86-5-a 86-6-a 86-7-a 86-8-a 86-9-a 86-10-a 86-11-a 86-12-a
二 待检 样品的混合
1 取96孔上样板和PCR中吸取过DNA的10μL枪头。
2 按照顺序排好PCR产物，按照以下量, 用10uL排枪分组添加如下产物到管底部。 注意，每个上样板都由三种产物混合，每次DNA吸取后，都要换枪头。
Table 1 Information for the labeld primers
Primer Label PCR frag length Color Group Volume (uL)
SsrPt_ctg1376 Cy5.5 88-124 Green 1 a 2
PtTX4001 Cy5 198-229 Blue 1 a 0.5
PtTX3107 D2 150-174 Black 1 a 4.5
SPAC12.5 Cy5.5 118-184 Green 2 b 2
SsrPt?_ctg4363 Cy5 95-106 Blue 2 b 0.5
PtTX3025 D2 211-305 Black 2 b 4.5
LOP1 Cy5.5 153-189 Green 3 c 2
PtTX3116 Cy5 115-169 Blue 3 c 0.5
PtTX2146 D2 176-264 Black 3 c 4.5
3取塑料纸盒，一般每板需要两个2mL ep管的HD，倒入纸盒内。取黄色枪头，每一管，加入30uL 已经混合好的Hi-Di (HD)，无需换枪头。
4 用新的黄枪头，将每一列孔的样品反复吸放几次，以混合均匀。 贴96孔板塑料膜。
5 短离心到2000rpm。
6（如有必要，每个孔滴入染料包内附带的一滴矿物油，防止样品蒸发）。
二 准备Separation Buffer板
地点：UPSC ，B3-28-48
1 取Buffer取样槽，倒入已经稀释好的Separation buffer，用电子排枪每个Separation buffer板孔中放入250uL的separation buffer。 确认无误后，将剩余Separationbuffer倒回瓶内。用双蒸水冲洗Buffer取样槽，用吸水纸擦干，放回原处。
2 取PAGE胶（在4°C冰箱），形如注射器，注意要事先将包装剪开。
三 从CEQ 8000中拷贝上一次运行的数据
1 双击打开CEQ >CEQ Main > Database(屏幕正下方中央倒数第五个图标)
在新开启的窗口下的导航栏中，选择对应的文件夹(Jinlong), 点击右键，选择 set as working database.
2 回到Jinlong 用户下，选择Default > Sample Data> ，在右侧显示的窗口中，将文件按照时间排序。
3 选择要导出的文件，右键export，选择scf作为导出格式。
4 将导出的文件拷贝到桌面Jinlong 文件夹中，新建一个文件夹，命名按照如下规则
例如:
2012-03-27-Plate-I-a （a表示第一组， 即SsrPt_ctg1376, PtTX4001和PtTX3107的混合样）
2012-03-28-Plate-I-b （b 表示第二组， 即SPAC12.5, SsrPt_ctg4363和PtTX3025的混合样）
2012-03-29-Plate-I-c （c表示第三组，即LOP1, PtTX3116 和PtTX2146的混合样）
2012-03-29 即日期 2012年3月29日
Plate-I 表示是第一板DNA的扩增产物。
5 将整个文件夹拷贝到USB Flash Disk中。
五 上样及运行：
注意： 一定要按照CEQ8000操作系统中的提示，换Separation Buffer， DNA sample 及 Wetting Tray， Gel Catridge。
1 打开CEQ > CEQ Main > Database (屏幕正下方工具栏的倒数第五个图标) > 选择Jinlong>右键 set as working database
2 洗Wetting tray。点击工具栏的Run图标，在新界面的菜单中，点击Replenish> Replenish wetting tray，提示 Do you want to replesh the wetting tray? 点OK。当出现上面的对话框显示为绿色时，可以打开上盖，wetting tray两端的卡子，取下Wetting tray， 打开后，倒掉里面的水及胶的混合液，用双蒸水冲洗。擦干后放回。
3 安装样品，在里面的支架上放样品，放好后再揭开贴膜，在外面的支架上放separation buffer，盖好separation buffer板的盖子, 点Done。
4 如果之前已经将胶卸载，并安装了黄色的Plug，则必须要从 Install gel catridge开始（Release gel catridge为灰色）。点击Install gel catridge，稍等几分钟后，“没有胶或者胶已经泄露”等信息，点击release gel。如果前面的胶未卸载，则直接点击Release gel catridge即可换下前面剩余的胶柱在注射器中。
5若提示 “Do you wish to release the gel cartridge?”,点OK。待出现“you may now open gel access and change gel catridge”的对话框，则可以打开下面的盖子，卸下已经安装好的黄色塞子（plug），将盛满胶的注射器的安装好。点击 Replenish>Install gel catridge,等待新胶柱安装好。
6. 用Direct control打出一些胶，目的是防止胶柱前端的空气进入毛细管中。一般需挤出为0.2mL路径： 菜单 >Direct control > Manifold Purge > 输入0.2mL即可。
7. 在屏幕正下方的控制界面中，点击Sample setup（工具条第一个），选择Create a new sample，从excel中拷贝96孔板的样品标签。
在出现的表格中，将96孔板的名称标签粘贴到两个view中（在页面最上面的check point）。第一个界面，每一列的最下方，都要选取Frag3，两个页面核对无误后保存，文件名参照统一命名格式 如 2012-03-29-Plate-I-a。表格将从白色变成蓝色。
8. 点击右上角的Run sample Plate
若出现对话框 Capillary Array usage exceeded. Do you want to continue? 选择 Yes
Select a sample plate to Run，选择刚刚保存的2012-03-29-Plate-I-a，
9 新弹出的屏幕左侧显示的是Buffer，右侧显示样品，高亮部分表明该板对应位置应该有样品和缓冲液。点击左下角的 Start开始进行毛细管电泳。
10 样品完成后的卸载和塞子安装。96孔板的毛细管电泳大约耗时10h，注意查看Log文件。全部结束后，冲洗wetting tray， Replesh > Replesh wetting tray, 冲洗好后，放回。点击Replenish > Release gel catridge , 提示 “Do you wish to release the gel catridge?” 点OK,等待1 – 2min， 胶柱卸载。
11. 换下用过的多半管胶，塞入黄色的塞子（Plug In），关好门后，显示点击 Replenish>Install Gel catridge 出现对话框，Install Plug In. 将没用用过的胶放回4°C冰箱保存。
https://blog.sciencenet.cn/blog-255662-660409.html
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共分为: DNA提取(离心柱法), 浓度测定, DNA提取的电泳检验, PCR, PCR产物的凝胶电泳检验,毛细管电泳, 96孔板进行DNA提取以及检验等.
全部内容, 均根据自己所做实验整理而成.
实验一 用试剂盒提取植物的全DNA
目的： 从针叶或种子提取裸子植物全DNA，用于SSR，Barcoding等进一步分析。
准备：
1. 取冰。冰在UPSC 二楼049房间。
2. 将Elution buffer 在65℃烘箱中预热。
操作步骤：
1. 每个待提取DNA样品取2枚针叶，在实验记录本上按照统一编号记录，并誊写样品标签上的所有信息。将2 mL圆底离心管按顺序编号，放在32孔板上。取约60mg针叶（Pinus sylvestris两针），剪碎（长宽不超过3mm），放入圆底离心管中。
2. 加入600μL SP1溶液，加入1μL RNase（在4℃冰箱中） 和 2粒瓷珠。
3. 在mixer mill上充分破碎，一般2min即可，若未打碎，继续破碎2min。
4. 将圆底离心管放在65℃ 金属浴，10min － 15min ，中间混合1－2次。
5. 加入210μL SP2，放冰上5min。
6. 14000rpm离心，5min。
*7. 取上清液到绿柱子，12000rpm，1min （对于种子，步骤可以省略）
8. 将上清液移到2mL新的圆底离心管，加入1.5倍体积的SP3（一般为500 － 700μL），混合均匀。
9. 将700μL上清液转移到蓝柱子（放在新的无盖离心管中，注意柱子和离心管都要标号）， 12000rpm， 1min，倒掉离心管下的液体。
10. 将第8步剩余的上清液继续转移到蓝柱子，12000rpm，1min，倒掉离心管下的液体。
11. 加入500μL的Washing Buffer到蓝柱子，12000rpm，1min，倒掉离心管下的液体。
12. 重复第11步。
13. 将蓝柱子放回原离心管离心，14000rpm，2min。
14. 取干净的EP管，标号。将蓝柱子放入干净的EP 管中，加入90μL 65℃ Elution Buffer洗脱，等候约4min， 12000rpm， 离心1min。
15. 丢弃蓝柱子，将EP管（下面的溶液即为提好的DNA）贴好标签，写上实验纪录上的编号，放入4℃冰箱保存。
如果为种子：
发芽至外露1－2cm，除去种皮， 整粒种子放入2mL圆底离心管。以下程序同。 最后洗脱用100μL Elution Buffer。若需要洗脱完全，则考虑用50μL进行第二次洗脱。
实验二 DNA样品的琼脂糖凝胶电泳检测
目的： 用琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取是否成功
准备：烘箱65℃，打开
操作步骤：
1 在电子天平上称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶。
2 用量筒量取120mLTBE溶液，倒入锥形瓶。
3 将锥形瓶在微波炉中加热三分钟，在沸腾后，轻摇几次，使得琼脂糖全部溶化。
4 放在常温冷却，待65℃左右，（至外边仍然比较烫手，但没有蒸气散出时）。加入8μL EB（溴化乙锭），摇匀。
5 将胶槽两端用不干胶封好，倒入30mL左右的溶液，插入胶孔成型用的梳子，待15到20分钟冷凝。将锥形瓶用多层保鲜膜盖好，并用铝箔封口，放在65℃的烘箱中。
6点 Loading Buffer。每一次取10μL的红色Loading Buffer，分成五份，每个约两μL，点在事先固定在tip盒盖的石蜡膜上。按照样品的数量，点出相应数量的Loading Buffer水珠。
7 点Lambda标准样（试剂公司合成的特定浓度的DNA样品），2μL，若是两排胶孔，应该点两个Lambda标准样。
8 吸取DNA样品，每个吸取2μL，为防止DNA样品的污染，每一次都要换枪头。按照次序点入Loading Buffer水珠中。
9 将胶放置在电泳槽中，令电泳液将其浸入。注意，胶孔一端要放在负极（黑色电极）一端。
10 点样，先在最左侧的胶孔中点入lambda样，将移液器的量程调至4－5μL，按照顺序，吸取水珠，点入胶孔中，此时不必每一次都换枪头。
11 将电泳仪电压调到80－110V之间，电泳15分钟。
12 取胶：先关闭电源，戴上蓝色在Techtum Lab AB凝胶成像系统中拍照。拍照时用MVPILOT软件，点击摄像机的图标，调整对比度和明暗效果，在左侧MITSUBISHI打印机上打印。保存图像时，点击照相机的图标。
13 完成拍照后，将凝胶丢弃，仪器擦拭干净，并保持Techtum Lab AB的门打开。
实验三 用Nanodrop检测DNA浓度
目的： Nanodrop分光光度计测量提取的DNA浓度
操作步骤：
1. 双击打开Nanodrop管理界面，点击Nucleic Acid Measurement。将Nanodrop的探测器旋臂抬起，用蒸馏水擦拭干净。
2. 用移液器吸取1μL 双蒸水（量程可调至1.2μL），点在探头上，盖好，点击Initialize按钮。
3. 打开探测器旋臂，用移液器点一滴Elution Buffer（这是由于之前用的是Elution Buffer，待测的DNA溶于什么溶液，就应该用相应的溶液作为本底对照），点击Blank按钮
4. 抬起旋臂，擦拭干净，换枪头，吸取1.2μL的待测样品，点Measure按钮，记录右下角的DNA浓度。
5． 依次重复步骤4，直至所有样品的浓度都测定完。
实验四 PCR 反应
步骤：
（1） 将引物成对摆放，9对引物一定要两两放在一起，并排号。在冰板上，放置9个 ep排管，用以9个不同的引物体系。因每排管由8个小ep管组成，每个96孔板上只能做8个DNA样品（8 *9 ＝ 72组合）。
（2） 将待检测模板DNA用ddH2O稀释到10ng /uL ，贴上标签，放在4℃保存。
（3） 按照DNA样品的数量，计算每对引物各组分的体积。每个组分扩大的倍数，取决于模板DNA的数目（实际情况下的体系的体积倍数要比DNA的数量稍多，每个1.5mL 的ep管内各组分需要到达足够的体积，才能准确量取以及混合）。
（4）取9个1.5mL的ep管，分别按照顺序，添加表1中除DNA模板外的组分。
表1 16uL PCR反应体系
order Constituents Storage Volume Per PCR Tube ×
1 ddH2O RT 11.85uL uL
2 PCR buffer 10× 4℃ 1.6uL uL
3 dNTP (25mM/uL) 4℃ 0.1uL (0.156mM) uL
4 Ordinary Primer (10uM) 4℃ 0.2uL (0.125uM) uL
5 With Dye Primer (10uM) 4℃ 0.2uL (0.125uM) uL
6 TopTaq (5 Unit/uL) －20℃ 0.05uL (0.25unit) uL
分装到各ep管，每管14uL
7 DNA template 2uL (10-20ng) 每个样品吸取2uL 模板DNA
Total 16uL
（5） 将混合好的体系，按照行，分装到同一排管的小ep管中，每个14uL。
（6） 从稀释过的DNA（约10ng/uL），吸取2uL，按照列，添加到排管的小ep管中。
（7） 手动混合反应体系，离心。 按照所需退火温度不同，分成三组：
第一组 LOP1和SsrPt_ctg4363，touch down 温度为 64 – 54℃
第二组 PtTx3107和PtTX4001，touch down 温度为55－45℃
第三组PtTX2146，PtTX3025，PtTX3116，SsrPt_ctg1376, SPAC12.5，touch down为60－50℃。 ?（8）每个PCR反应耗时约2－2.5h。注意，PCR仪在最后的延伸完成后，会降到15℃，应该尽快将产物转移到4℃冰箱中， 并尽快检测。
Table 2. Primers and PCR conditions for each locus (Part I) version 0.3
ID 1 2 3 4 5
Locus LOP1 PtTX2146 PtTX3025 PtTX3107 PtTX3116
Dye Cy5.5 green D2 Black D2 Black D2 Black Cy5 Blue
Forward(5-3) GGCTAATGGCCGGCCAGTGCT CCTGGGGATTTGGATTGGGTATTTG CACGCTGTATAATAACAATCTA AAACAAGCCCACATCGTCAATC CCTCCCAAAGCCTAAAGAAT
Reverse(5-3) GCGATTACAGGGTTGCAGCCT ATATTTTCCTTGCCCCTTCCAGACA TTCTATATTCGCTTTTAGTTTC TCCCCTGGATCTGAGGA CATACAAGGCCTTATCTTACAGAA
Ta Touch down 64-54°C Touch down 60-50°C Touch down 60-50°C Touch down 55-45°C Touch down 60-50°C
size range 153-189 176-264 211-305 150-174 115-169
PCR Conditions
1 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation
18 cycles 2 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s
3 30 S from 64 °C to 54 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 55°C to 45 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle
4 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S
25
cycles 5 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s
6 54 °C 30s 50 °C 30s 50 °C 30s 45 °C 30s 50 °C 30s
7 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s
Final extention 8 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min
Preservation 15°C -- 15°C -- 15°C -- 15°C -- 15°C --
Date: 2012-3-13
Jinlong
Table 2. Primers and PCR conditions for each locus (Part II) version 0.3
ID 6 7 8 9
Locus PtTX4001 SsrPt_ctg1376 SsrPt_ctg4363 SPAC12.5
Dye Cy5 Blue Cy5.5 Green Cy5 Blue Cy5.5 Green
Forward(5-3) CTATTTGAGTTAAGAAGGGAGTC CGATATTATGGATTTTGCTTGTGA TAATAATTCAAGCCACCCCG CTTCTTCACTAGTTTCCTTTGG
Reverse(5-3) CTGTGGGTAGCATCATC AAATGCATGCCAAACTTAAATAC AGCAGGCTAATAACAACACGC TTGGTTATAGGCATAGATTGC
Ta Touch down 55-45°C Touch down 60-50°C Touch down 64-54°C Touch down 60-50°C
size range 198-229 88-124 95-106 118-184
PCR Conditions
1 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation 94 °C 3min initial denaturation
18 cycles 2 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s
3 30 S from 55°C to 45 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 64 °C to 54 °C decrease 0.6 per cycle 30 S from 60 °C to 50 °C decrease 0.6 per cycle
4 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S 72 °C 30S
25
cycles 5 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s 94 °C 30s
6 45 °C 30s 50 °C 30s 54 °C 30s 50 °C 30s
7 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s 72 °C 30s
Final
extention 8 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min 72°C 10 min
Preservation 15°C -- 15°C -- 15°C -- 15°C --
Date: 2012-3-13
Jinlong
实验五 PCR产物的检测
步骤：
一 治胶
1 在电子天平上称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶。
2 用量筒量取120mLTBE溶液，倒入锥形瓶。
3 将锥形瓶在微波炉中加热三分钟，在沸腾后，轻摇几次，使得琼脂糖全部溶化。
4 放在常温冷却，待65℃左右，（至外边仍然比较烫手，但没有蒸气散出时）。加入0.8μL EB（溴化乙锭），摇匀。
1 － 4 仅适用于首次做胶时参考。
5 将胶槽两端用不干胶封好，倒入30mL左右的溶液，插入胶孔成型用的梳子，待15到20min冷凝。将盛有剩余溶胶的锥形瓶用多层保鲜膜盖好，并用铝箔封口，放在65℃的烘箱中。
二 点样
6点 Loading Buffer。每一次取10μL的红色Loading Buffer，分成五份，每个约2μL，点在事先固定在tip盒盖的石蜡膜上。按照样品的数量，点出相应数量的Loading Buffer水珠。
7 点Ladder DNA标准样，5μL，若是两排胶孔，应该点Ladder DNA标准样。
8 吸取DNA样品，每个吸取4μL，为防止DNA样品的污染，每一次都要换枪头。按照次序点入Loading Buffer的水珠中。
9 将胶放置在电泳槽中，令电泳液将其浸入。注意，胶孔一端要放在负极（黑色电极）一端。
10 点样，先在最左侧的胶孔中点入lambda样，将移液器的量程调至4－5μL，按照顺序，吸取水珠，点入胶孔中，此时不必每一次都换枪头。
三 电泳
11 将电泳仪电压调到80－110V之间，电泳15分钟。
四 紫外光检测
12 取胶：先关闭电源，戴上蓝色在Techtum Lab AB凝胶成像系统中拍照。拍照时用MVPILOT软件，点击摄像机的图标，调整对比度和明暗效果，在左侧MITSUBISHI打印机上打印。保存图像时，点击照相机的图标。
13 完成拍照后，将凝胶丢弃，仪器擦拭干净，并保持Techtum Lab AB的门打开。
实验六 用96孔板提取Scots Pine种子DNA
准备：
SP1 在使用前，每200μL加入1uL的RNAse， 如研磨2×96材料，则取SP1 40mL，加入200uLRNAse。 放在65℃烘箱预热。
Elution Buffer 65℃预热
步骤：
1. 取96孔板，每个孔放1颗瓷珠，1粒Scots Pine种子，盖好。
2. 充分研磨破碎1min，在UPSC 6th floor。3700rpm离心1，使碎片落入管底，继续破碎1min。
3. 开盖加入200μL SP1，放65℃ 烘箱中10min，混匀两次，将壁上的液体离心到底部（2000rpm）
4 .加入70μL SP2，盖好，混匀，短离心，
5 .放入-20℃冰箱 10min
6. 3700rpm 离心10min
7. 将上清液移动到1.2mL管中（约200μL）
8. 加入1.5体积的SP3 （约300μL）
9. 盖好，混匀20s， 短离心（到3000rpm）
10. 将柱子板放方孔底座上，每孔加入150μL Equilibration Buffer， 混匀，静置4min， 3000rpm离心 2min
11. 每个管中取500μL样品移到 HiBind DNA柱子板上，置于方孔底座上。
12. 盖好尼龙膜，3700rpm离心 3min。
13. 去掉尼龙膜，倒掉方孔底座中的液体。
14. 加入800μL SPW Wash Buffer， 盖好尼龙膜， 3700离心3min，倒掉方孔底座中的液体。
15. 加入800μL SPW Wash Buffer， 3700离心5min，倒掉方孔底座中的液体，再离心10min，以彻底去掉乙醇，倒掉方孔底座中的液体。放在通风厨10分钟，晾干。
16. 将柱子板放在1.2mL排管上，用100μL 65℃ 预热的Elution Buffer洗脱。在65℃温箱中静置5min。 3700rpm离心 5min。
17. 1.2mL排管盖好，保存在4℃冰箱中，其余丢弃。
对DNA进行常规琼脂糖凝胶电泳检测， 2uLDNA， lambda标准样 2uL
20120329
实验七96孔板PCR
1 稀释模板DNA
将提取到的总 DNA 吸取到96孔板上，根据Nanodrop对DNA的测量结果，用ddH2O稀释到10-20ng/uL，需要根据PCR的次数和每次DNA样品量确定要吸 取的DNA量，保证取样量至少多15uL以上。作为模板DNA，写清楚模板DNA的序号，日期，标签如下 Plate-I，放在4°C保存。
2 准备模板标签
对于96孔板，每一格填写如下信息： 1 序号（1-96，一般按照列保存） 2 DNA序列号（如E4218） 3 树编号 （UID，即每棵树所取的哪颗种子 如 81-8，表示81号树的第8颗种子）。
3 模板DNA取样
用排枪取2μL的模板DNA，加入到到96孔板管底部。由于不带有荧光，模板DNA的枪头可收集起来，可以作为毛细管电泳时混合样品用的枪头，但是要做好标记。
4 混合反应体系 Master Mix
No. Conponent Volume per tube Concentration ×25 Storage
1 ddH2O 10.95 - 273.75 RT
2 10×PCR buffer 1.6 - 40 -4°C
3 2.5mM dNTP 1 0.15625 25 -4°C
4 Forward Primer 0.2 0.125 5 -4°C
5 Reverse Primer 0.2 0.125 5 -4°C
6 Top Taq 0.05 2.5U 1.25 -20°C
对于任意一板的PCR反应，需要准备4个1.5mL的ep管，先放在冰盒上，按照1-6的顺序添加各组分到ep管中。盖好盖子，短离心，涡旋，短离心，确保体系混合均匀。
5 用电子移液器（该移液器每次可吸取100μL，由于需要加入的反应体系是14μL，因此只能加7次，注意第一次吸取的液体要打掉，长音表明是最后一次），吸取反应体系，每管加入14μL。
6 在96孔板的边缘标记好Plate号，引物名称等，之后贴Bio-Rad的PCR厚膜，用手柄压实，确保每一管的封口都严密。
7 在振荡器上涡旋4-5下，确保反应体系和模板DNA充分混合。短离心，达到2000rpm以上。
8 按照如下条件，设定touch down PCR:
Tab.1 LOP1 TD 64 to 54 Tab. 2 PtTX2146 TD 60 to 50
Tab.3 PtTX3025 TD 55 to 45 Tab. 4 PtTX3107 TD 55 to 45
Tab.5 PtTX3116 TD 60 to 50 Tab. 6 PtTX4001 TD 60 to 50
Tab.7 SsrPt_ctg1376 TD 60 to 50 Tab. 8 SsrPt_ctg4363 TD 64 to 54
Tab.9 SPAC12.5 TD 55 to 45
9 每个PCR需要耗时2.5h左右。反应结束后，将产物放到4°C冰箱中保存。
10. 对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，一般每板随机抽检16个样品，点样的量一般为：
Loading Buffer 2.5 μL
PCR产物 3μL
Ladder DNA 5μL
实验七96孔板PCR
1 稀释模板DNA
将提取到的总 DNA 吸取到96孔板上，根据Nanodrop对DNA的测量结果，用ddH2O稀释到10-20ng/uL，需要根据PCR的次数和每次DNA样品量确定要吸 取的DNA量，保证取样量至少多15uL以上。作为模板DNA，写清楚模板DNA的序号，日期，标签如下 Plate-I，放在4°C保存。
2 准备模板标签
对于96孔板，每一格填写如下信息： 1 序号（1-96，一般按照列保存） 2 DNA序列号（如E4218） 3 树编号 （UID，即每棵树所取的哪颗种子 如 81-8，表示81号树的第8颗种子）。
3 模板DNA取样
用排枪取2μL的模板DNA，加入到到96孔板管底部。由于不带有荧光，模板DNA的枪头可收集起来，可以作为毛细管电泳时混合样品用的枪头，但是要做好标记。
4 混合反应体系 Master Mix
No. Conponent Volume per tube Concentration ×25 Storage
1 ddH2O 10.95 - 273.75 RT
2 10×PCR buffer 1.6 - 40 -4°C
3 2.5mM dNTP 1 0.15625 25 -4°C
4 Forward Primer 0.2 0.125 5 -4°C
5 Reverse Primer 0.2 0.125 5 -4°C
6 Top Taq 0.05 2.5U 1.25 -20°C
对于任意一板的PCR反应，需要准备4个1.5mL的ep管，先放在冰盒上，按照1-6的顺序添加各组分到ep管中。盖好盖子，短离心，涡旋，短离心，确保体系混合均匀。
5 用电子移液器（该移液器每次可吸取100μL，由于需要加入的反应体系是14μL，因此只能加7次，注意第一次吸取的液体要打掉，长音表明是最后一次），吸取反应体系，每管加入14μL。
6 在96孔板的边缘标记好Plate号，引物名称等，之后贴Bio-Rad的PCR厚膜，用手柄压实，确保每一管的封口都严密。
7 在振荡器上涡旋4-5下，确保反应体系和模板DNA充分混合。短离心，达到2000rpm以上。
8 按照如下条件，设定touch down PCR:
Tab.1 LOP1 TD 64 to 54 Tab. 2 PtTX2146 TD 60 to 50
Tab.3 PtTX3025 TD 55 to 45 Tab. 4 PtTX3107 TD 55 to 45
Tab.5 PtTX3116 TD 60 to 50 Tab. 6 PtTX4001 TD 60 to 50
Tab.7 SsrPt_ctg1376 TD 60 to 50 Tab. 8 SsrPt_ctg4363 TD 64 to 54
Tab.9 SPAC12.5 TD 55 to 45
9 每个PCR需要耗时2.5h左右。反应结束后，将产物放到4°C冰箱中保存。
10. 对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，一般每板随机抽检16个样品，点样的量一般为：
Loading Buffer 2.5 μL
PCR产物 3μL
Ladder DNA 5μL
实验八在CEQ 8000上进行毛细管电泳
一 准备Excel 作为样品的Label
每一板混合样的侧面，应该用记号笔标注清楚 ，例如2012-03-29-Plate-I-a
标签 文件，应该保存在Excel中，待毛细管电泳时，直接拷贝到CEQ8000的界面中。
表 2 96孔板标签的排列
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 69-1-a 69-2-a 69-3-a 69-4-a 69-5-a 69-6-a 69-7-a 69-8-a 69-9-a 69-10-a 69-11-a 143-4-a
B 71-1-a 71-2-a 71-3-a 71-4-a 143-1-a 143-2-a 71-7-a 71-8-a 143-3-a 71-10-a 71-11-a 71-12-a
C 73-1-a 73-2-a 73-3-a 73-4-a 73-5-a 73-6-a 73-7-a 73-8-a 73-9-a 73-10-a 73-11-a 73-12-a
D 74-1-a 74-2-a 74-3-a 74-4-a 74-5-a 74-6-a 74-7-a 74-8-a 74-9-a 74-10-a 74-11-a 74-12-a
E 81-1-a 81-2-a 81-3-a 81-4-a 81-5-a 81-6-a 81-7-a 81-8-a 81-9-a 81-10-a 81-11-a 81-12-a
F 82-1-a 82-2-a 82-3-a 82-4-a 82-5-a 82-6-a 82-7-a 82-8-a 82-9-a 82-10-a 82-11-a 82-12-a
G 84-1-a 84-2-a 84-3-a 84-4-a 84-5-a 84-6-a 84-7-a 84-8-a 84-9-a 84-10-a 84-11-a 84-12-a
H 86-1-a 86-2-a 86-3-a 86-4-a 86-5-a 86-6-a 86-7-a 86-8-a 86-9-a 86-10-a 86-11-a 86-12-a
二 待检 样品的混合
1 取96孔上样板和PCR中吸取过DNA的10μL枪头。
2 按照顺序排好PCR产物，按照以下量, 用10uL排枪分组添加如下产物到管底部。 注意，每个上样板都由三种产物混合，每次DNA吸取后，都要换枪头。
Table 1 Information for the labeld primers
Primer Label PCR frag length Color Group Volume (uL)
SsrPt_ctg1376 Cy5.5 88-124 Green 1 a 2
PtTX4001 Cy5 198-229 Blue 1 a 0.5
PtTX3107 D2 150-174 Black 1 a 4.5
SPAC12.5 Cy5.5 118-184 Green 2 b 2
SsrPt?_ctg4363 Cy5 95-106 Blue 2 b 0.5
PtTX3025 D2 211-305 Black 2 b 4.5
LOP1 Cy5.5 153-189 Green 3 c 2
PtTX3116 Cy5 115-169 Blue 3 c 0.5
PtTX2146 D2 176-264 Black 3 c 4.5
3取塑料纸盒，一般每板需要两个2mL ep管的HD，倒入纸盒内。取黄色枪头，每一管，加入30uL 已经混合好的Hi-Di (HD)，无需换枪头。
4 用新的黄枪头，将每一列孔的样品反复吸放几次，以混合均匀。 贴96孔板塑料膜。
5 短离心到2000rpm。
6（如有必要，每个孔滴入染料包内附带的一滴矿物油，防止样品蒸发）。
二 准备Separation Buffer板
地点：UPSC ，B3-28-48
1 取Buffer取样槽，倒入已经稀释好的Separation buffer，用电子排枪每个Separation buffer板孔中放入250uL的separation buffer。 确认无误后，将剩余Separationbuffer倒回瓶内。用双蒸水冲洗Buffer取样槽，用吸水纸擦干，放回原处。
2 取PAGE胶（在4°C冰箱），形如注射器，注意要事先将包装剪开。
三 从CEQ 8000中拷贝上一次运行的数据
1 双击打开CEQ >CEQ Main > Database(屏幕正下方中央倒数第五个图标)
在新开启的窗口下的导航栏中，选择对应的文件夹(Jinlong), 点击右键，选择 set as working database.
2 回到Jinlong 用户下，选择Default > Sample Data> ，在右侧显示的窗口中，将文件按照时间排序。
3 选择要导出的文件，右键export，选择scf作为导出格式。
4 将导出的文件拷贝到桌面Jinlong 文件夹中，新建一个文件夹，命名按照如下规则
例如:
2012-03-27-Plate-I-a （a表示第一组， 即SsrPt_ctg1376, PtTX4001和PtTX3107的混合样）
2012-03-28-Plate-I-b （b 表示第二组， 即SPAC12.5, SsrPt_ctg4363和PtTX3025的混合样）
2012-03-29-Plate-I-c （c表示第三组，即LOP1, PtTX3116 和PtTX2146的混合样）
2012-03-29 即日期 2012年3月29日
Plate-I 表示是第一板DNA的扩增产物。
5 将整个文件夹拷贝到USB Flash Disk中。
五 上样及运行：
注意： 一定要按照CEQ8000操作系统中的提示，换Separation Buffer， DNA sample 及 Wetting Tray， Gel Catridge。
1 打开CEQ > CEQ Main > Database (屏幕正下方工具栏的倒数第五个图标) > 选择Jinlong>右键 set as working database
2 洗Wetting tray。点击工具栏的Run图标，在新界面的菜单中，点击Replenish> Replenish wetting tray，提示 Do you want to replesh the wetting tray? 点OK。当出现上面的对话框显示为绿色时，可以打开上盖，wetting tray两端的卡子，取下Wetting tray， 打开后，倒掉里面的水及胶的混合液，用双蒸水冲洗。擦干后放回。
3 安装样品，在里面的支架上放样品，放好后再揭开贴膜，在外面的支架上放separation buffer，盖好separation buffer板的盖子, 点Done。
4 如果之前已经将胶卸载，并安装了黄色的Plug，则必须要从 Install gel catridge开始（Release gel catridge为灰色）。点击Install gel catridge，稍等几分钟后，“没有胶或者胶已经泄露”等信息，点击release gel。如果前面的胶未卸载，则直接点击Release gel catridge即可换下前面剩余的胶柱在注射器中。
5若提示 “Do you wish to release the gel cartridge?”,点OK。待出现“you may now open gel access and change gel catridge”的对话框，则可以打开下面的盖子，卸下已经安装好的黄色塞子（plug），将盛满胶的注射器的安装好。点击 Replenish>Install gel catridge,等待新胶柱安装好。
6. 用Direct control打出一些胶，目的是防止胶柱前端的空气进入毛细管中。一般需挤出为0.2mL路径： 菜单 >Direct control > Manifold Purge > 输入0.2mL即可。
7. 在屏幕正下方的控制界面中，点击Sample setup（工具条第一个），选择Create a new sample，从excel中拷贝96孔板的样品标签。
在出现的表格中，将96孔板的名称标签粘贴到两个view中（在页面最上面的check point）。第一个界面，每一列的最下方，都要选取Frag3，两个页面核对无误后保存，文件名参照统一命名格式 如 2012-03-29-Plate-I-a。表格将从白色变成蓝色。
8. 点击右上角的Run sample Plate
若出现对话框 Capillary Array usage exceeded. Do you want to continue? 选择 Yes
Select a sample plate to Run，选择刚刚保存的2012-03-29-Plate-I-a，
9 新弹出的屏幕左侧显示的是Buffer，右侧显示样品，高亮部分表明该板对应位置应该有样品和缓冲液。点击左下角的 Start开始进行毛细管电泳。
10 样品完成后的卸载和塞子安装。96孔板的毛细管电泳大约耗时10h，注意查看Log文件。全部结束后，冲洗wetting tray， Replesh > Replesh wetting tray, 冲洗好后，放回。点击Replenish > Release gel catridge , 提示 “Do you wish to release the gel catridge?” 点OK,等待1 – 2min， 胶柱卸载。
11. 换下用过的多半管胶，塞入黄色的塞子（Plug In），关好门后，显示点击 Replenish>Install Gel catridge 出现对话框，Install Plug In. 将没用用过的胶放回4°C冰箱保存。
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